Das aktuelle Protokoll trägt zur Untersuchung der Gehirnmechanismen bei, die einem geschickten motorischen Verhalten zugrunde liegen. Die drahtlose Optogenetik ermöglicht die Manipulation bestimmter Neuronen, während die Probanden eine Aufgabe in freier Bewegung ausführen. In Kombination mit der Hochgeschwindigkeits-Videografie ist eine detaillierte Analyse des feinmotorischen Verhaltens möglich.
Die Methode könnte helfen, motorische Probleme bei neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen zu verstehen. Diese Techniken können verwendet werden, um die Gehirnfunktion auch in anderen Verhaltensparadigmen zu untersuchen. Diana Rodriguez-Munoz, eine Studentin aus meinem Labor, wird beim Experimentieren helfen.
Beginnen Sie für die chirurgischen Eingriffe mit der Vorbereitung einer LED-Kanüle der gewünschten Länge gemäß den dorso-ventralen Koordinaten der interessierenden Struktur. Schneiden Sie dazu die Glasfaser auf eine Länge, die länger als die endgültige gewünschte Größe ist, und schleifen Sie die Faserspitze mit grobem Schleifpapier auf die Ziellänge. Dann polieren Sie die Faserspitze mit feinem Schleifpapier.
Für Mikroinjektionen eine Pipette mit dem Mineralöl füllen und die Pipette in den Mikroinjektor geben. Stellen Sie sicher, dass der Mikroinjektor korrekt funktioniert, indem Sie etwas Mineralöl injizieren. Als nächstes bereiten Sie die betäubte Maus auf die Operation vor, indem Sie eine Augensalbe auftragen und Haare von der Kopfhaut mit einem Trimmer und einer Haarentfernungscreme entfernen.
Wischen Sie dann die Kopfhaut mit Wattestäbchen ab, die jeweils dreimal 8% Povidonjod und 70% Ethanol enthalten. Legen Sie die Maus nach der Desinfektion in den stereotaktischen Apparat und sichern Sie den Kopf, um sicherzustellen, dass der Schädel in den medial-lateralen und anterior-posterioren Achsen nivelliert ist. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Einschnitt von einem Zentimeter durch die Kopfhaut auf Augenhöhe entlang der Sagittalachse zu machen.
Ziehen Sie dann die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und reinigen Sie das Periost mit Wattestäbchen. Reinigen Sie die Schädeloberfläche mit Kochsalzlösung und Wattestäbchen und lösen Sie Blutungen an der Oberfläche mit sterilen saugfähigen Augenspeeren. Tragen Sie dann einen Tropfen 2,5% Wasserstoffperoxid mit einem Wattestäbchen auf und lassen Sie es einige Sekunden einwirken, um die Schädelnähte sichtbar zu machen und eine bessere Referenz zu haben.
Reinigen Sie den Bereich nach einigen Sekunden gründlich mit einem sauberen Wattestäbchen. Mit einer Glaspipette mit einem Endspitzendurchmesser von 15 Mikrometern können Sie Bregma und Lambda lokalisieren, um zu überprüfen, ob der Schädel in der vorder-hinteren Achse nivelliert ist. Malen Sie dann einen Referenzpunkt in der Kopfhaut über den ausgewählten Koordinaten mit einer Markierung.
Führen Sie im Referenzpunkt eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von einem Millimeter durch, indem Sie mit einem Drehwerkzeug bei niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit mit einem kleinen, runden Zahnbohrer einen sanften Druck auf den Schädel ausüben. Wenn Sie fertig sind, verschieben Sie die Kapillare in Richtung der ausgewählten vorder-hinteren oder AP- und medial-lateralen oder ML-Koordinaten. Laden Sie die Kapillare mit 300 bis 400 Nanolitern des CreE-abhängigen Adeno-assoziierten Virus oder AAV, wie AAV1, D-flox Channelrhodopsin mCherry, um Channelrhodopsin in der Region von Interesse zu exprimieren.
Ein AAV kann als Kontrolle verwendet werden, um das Reporterprotein zu exprimieren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Spitze nicht verstopft ist, führen Sie die Glaspipette im Gehirn an den dorso-ventralen minus 3,35 Millimeter-Koordinaten im dorsal-lateralen Striatum ein und injizieren Sie 200 Nanoliter des Virus mit einem automatischen Injektor mit einer Rate von 23 Nanolitern pro Sekunde. Warten Sie nach der Injektion 10 Minuten, bevor Sie die Glaspipette langsam abziehen, um ein Verschütten zu vermeiden.
Dann reinigen und trocknen Sie alle Rückstände mit Wattestäbchen. Als nächstes befestigen Sie die Glas-LED-Kanüle am stereotaktischen Arm und kalibrieren Sie die Koordinaten mit Bregma als Referenz. Führen Sie dann die Kanüle langsam ein, um Gewebeschäden zu vermeiden, und legen Sie sie 100 Mikrometer über die Injektionsstelle.
Sobald die LED-Kanüle an Ort und Stelle ist, fügen Sie einen Tropfen von 100 Mikrolitern Gewebekleber am Rand der Kraniotomie hinzu. Verwenden Sie eine sterile Bürste, um nach und nach eine frisch zubereitete Zahnzementmischung um den Kanülenverbinder aufzutragen und Schichten aufzubauen, bis der Schädel bedeckt ist und der Verbinder sicher am Schädel befestigt ist, so dass die Stifte völlig frei bleiben. Wenn der Zement vollständig getrocknet ist, schließen Sie die Haut um das Implantat mit Gewebekleber.
Legen Sie die Maus dann in einen Erholungskäfig über einem Heizkissen bei 33 Grad Celsius, während Sie auf die Anzeichen von Unbehagen oder Schmerzen achten. Zeichnen Sie das Verhalten des Tieres mit einer normalen Kamera auf und erfassen Sie 30 bis 60 Bilder pro Sekunde von der Vorderseite der Kammer. Ein Spiegel kann in einem Winkel von 45 Grad unter der Trainingskammer platziert werden, um die Haltung des Tieres zu überwachen.
Wenn Mäuse beginnen, das Pellet zu erreichen, drehen Sie die LED-Kanüle manuell mit der Fernbedienung, um eine kontinuierliche Stimulation für die Zeit zu haben, in der das Verhalten nicht länger als zwei Sekunden ausgeführt wird. Das Stimulationsgerät löst eine LED von 470 Nanometern mit einer Intensität an der Spitze von einem Milliwatt pro Millimeterquadrat aus. Das feinmotorische Verhalten des Tieres unter optogenetischen Manipulationen wurde mit der Reach-to-Grasp-Aufgabe untersucht.
Die Mäuse lernten, die Aufgabe in ein paar Tagen auszuführen und erreichten eine Genauigkeit von mehr als 55% und erreichten nach fünf Tagen Training ein Plateau. Die Flugbahn der Bewegungen wurde mit Hochgeschwindigkeits-Videografie verfolgt, was eine Analyse der Kinematik ermöglichte. Die quantifizierbare Bewertung von Parametern wie zurückgelegte Strecke, Geschwindigkeit, Beschleunigung, Endpunkt und Trajektorie wurde durchgeführt.
In den verpassten Versuchen starteten die Mäuse die Greifbewegung weiter weg vom Pellet als die Hit-Versuche. Darüber hinaus waren Fehler signifikant mit der Maushaltung verbunden, was sich in Unterschieden im Körperwinkel während der Treffer- und Fehlversuche zeigte. Die kontralaterale Aktivierung von D1-Dopamin-exprimierenden stacheligen Projektionsneuronen oder SPNs reduzierte den Greiferfolg im Vergleich zu den Kontrollbedingungen.
Während einer optogenetischen Stimulation nahm die Flugbahn der Pfote in der Reiseentfernung zu, was zu der Unfähigkeit führte, das Pellet anzuvisieren, und zu einer Zunahme des anfänglichen Fehlertyps eins. Die Principle Component Analysis (PCA) zeigte, dass sich alle Studientrajektorien während der kontralateralen D1-SPNs-Aktivierung in einem Cluster mit nahezu keiner Überlappung mit dem Kontrollcluster trennten, was auf eine geringe Ähnlichkeit hinweist. Die Aktivierung der DSPNs auf der ipsilateralen Seite führte zu einer Zunahme der Trajektoriendispersion, die durch die PCA-Analyse gezeigt wurde.
Daher veränderte die ipsilaterale D1-SPNs-Aktivierung die Zielbahn, ohne das Verhaltensergebnis zu ändern. Achten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls darauf, die Kanüle richtig zu platzieren, damit sie sich während der Trainingseinheiten nicht löst. Diese Methode kann in anderen Verhaltensparadigmen verwendet werden, um motorisches Verhalten, sensorische Verarbeitung, Lernen und Gedächtnis zu untersuchen.
Die drahtlose Optogenetik wird es ermöglichen, naturalistisches Verhalten und seine neurobiologischen Grundlagen bei sich wirklich frei bewegenden Probanden zu untersuchen.
