These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

! ACHTUNG: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Laser der Klasse 3b und der richtigen Ausbildung und Sicherheitsrichtlinien erfordern, zu beachten. Schutzbrille muss jederzeit im Betrieb Laser getragen werden, mit Assoziierung Verfahren stellt ein besonders hohes Risiko. Kontaktieren Sie den Laser-Anbieter, um die Brillen, die maximale Dämpfung für einen bestimmten Laser bieten wird zu bestimmen. Falls verfügbar, einschreiben in einem institutionellen Laserschutz-Schulung. Nie einen Laser zu betreiben, ohne die entsprechende Schutzbrillen und Ausbildung. 1. Laser Apparat Set-up Gegebenenfalls werden die Schritte in Abschnitt 1 (A) oder (B) bezeichnet, um zwischen einem oder zwei Lasersystemen zu unterscheiden sind. <ol><li> Befestigen und sichern Sie Laser mit dem Steckbrett. Breadboards sind hervorragende Wärmeleiter und fungieren als Kühlkörper, um Schäden an internen Laserkomponenten bei längerem Gebrauch zu verhindern. </li><li> (A) Befestigen Sie den Pre-gekoppelten laser auf eine 10 &quot;x 12&quot; Steckbrett (oder nach Bedarf) mit ¼-20 &quot;Kopfschrauben und Unterlegscheiben (Abbildung 2A). Wenn Steckbrett Löcher nicht mit Laser-Befestigungslöcher auszurichten, verwenden Sie kleine &quot;Tischklemmen&quot; zu sichern, um Lasersteckbrett. </li><li> (B) Wenn die 2-Laser verwendet werden sehr unterschiedliche Strahlhöhen (&gt; ~ 1 cm), verwenden Sie kleine 4 &quot;x 6&quot; Breadboards, eine Plattform für einen der Laser zu schaffen. Bringen Sie diese Boards zu den wichtigsten großen 12 &quot;x 18&quot; Steckbrett mit ¼-20 &quot;Zylinderschrauben mit Unterlegscheiben, dann bringen Sie den Laser auf den kleineren Platten mit Schrauben oder Tischklemmen wie in 2B gezeigt. Schließen Sie das andere Laser direkt auf das Steckbrett mit Schrauben oder eine variable Höhe Tischklemme. Critical Schritt: Breadboards, Schrauben und optischen Komponenten können als metrische oder das Zoll erworben werden so konsequent sein beim Kauf von Artikeln; der Standard für dieses Protokoll ist Kaiser. </li><li> (A)Bringen Sie einen dicken Mantelflach spalten / Körperkontakt (FC / PC) Patchkabel an den Koppler (als Koppler Kabel bezeichnet; siehe Abbildung 3), die physisch mit dem vor dem Laser (2A) verbunden ist. </li><li> (B) Führen Sie den Koppler auf eine ¾ &quot;optischen Post, dann Epoxid die Verbindung zwischen dem Koppler und der Spitze der Post mit JB Kwik oder ähnliche Epoxy, Lösen und Fehlausrichtung während der Verwendung zu verhindern. Befestigen Sie den Pfosten mit dem Steckbrett (wie die Steckbrett Bohrungen decken sich nicht immer eine Linie mit der gewünschten Anordnung von optischen Komponenten, ein Posthalter, Standfuß Adapter und Klemmgabel verwendet werden, um des Kopplers optisch Beitrag zu befestigen). Bringen Sie einen dicken Mantelpatchkabel (Koppler Kabel) an der Rückseite des Kopplers. </li><li> (B) Legen Sie die erste Lenkspiegel für den blauen Laser in die kinematische Halterung und befestigen Sie es mit dem Steckbrett mit einem ¾ &quot;optischen Post. Fügen Sie diesen Beitrag zu einer Basis adapter und Spanngabel. Positionieren Sie die Spanngabel und veröffentlichen Montage direkt vor dem blauen Laser mit Spiegel um 45 ° gedreht, um den Laser auf die dichroitischen Spiegel lenken. Verwenden Sie das Raster der Bohrungen auf dem Steckbrett als grobe Ausrichtungsführung. Sobald grob positioniert, mit einem ¼ &quot;-20 Schraube, um die Spanngabel mit dem Steckbrett zu sichern (siehe Abbildung 2B, C). </li><li> (B) Legen Sie die dichroitischen Spiegel in eine kinematische Halterung und befestigen es an einem 1 &quot;optischen Post und direkt zu sichern, um dem Steckbrett. Positionieren Sie den dichroitischen Spiegel auf die weit von links, und in Übereinstimmung mit, blauen Laserspiegel. Winkel der dichroitische Spiegel in einem Winkel von 45 °, so dass blaues Licht reflektiert den ersten Spiegel in den Koppler reflektiert, dann ziehen Sie die Schraube Befestigung des kinematischen Halterung an der Säule (siehe Abbildung 2B, C). </li><li> (B) Befestigen Sie den ersten Umlenkspiegel für die gelbe Laser zu einem ¾ &quot;optischen Post. Befestigen Sie die optical Beitrag zu einem Basisteil und Spanngabel. Positionieren Sie die Spanngabel und Post-Ensemble direkt vor dem gelben Laser und Winkel der Spiegel in einem Winkel von 45 °, so dass gelbes Licht wird in Richtung des zweiten Steuerspiegel gerichtet werden. Sichern Sie die Spanngabel in Ort mit einem ¼ &quot;-20 Kopfschraube und Unterlegscheibe. </li><li> (B) Befestigen Sie den zweiten Steuerspiegel für die gelbe Laser zu einem 1 &quot;optischen Post. Winkel der Spiegel, so daß die gelbe Lichtstrahl von dem ersten Spiegel wird durch den dichroitischen und in den Koppler (2C) reflektiert werden. Sichern Sie die Post direkt an die Steckbrett und ziehen Sie die Befestigungsschraube, wenn der Spiegel ist abgewinkelt angemessen. Feine Spiegel Anpassungen werden über die kinematische Spiegelhalter in einem späteren Schritt durchgeführt werden. </li><li> (B) Schließen Sie einen Neutraldichtefilter Rad zu einem ¾ &quot;optischen Post und legen Sie die Post in eine Stelleninhaber zu einer Montageplatte befestigt. Sichern Sie das Ensemble mit dem Steckbrett zwischen dem ersten und second gelbe Spiegel mit einem einzigen ¼ &quot;-20 Schraube. Dieses Rad wird verwendet, um die Kraft der gelben Laserlicht erreicht den Koppler anzupassen. Tipp: Alle Komponenten (wie die Schrauben, mit denen kinematische Spiegelhalter an die Spitze der Beiträge und den Fäden hält Basisadapter auf den Boden der Beiträge), bevor Sie sie an die Basis individuell fest. Verwenden Sie eine Welle eines kleinen Sechskantschlüssel in den Durchgangslöchern in der optischen Kommentare über genügend Drehmoment zu erhalten. Dadurch wird verhindert, Komponenten Lösen während des Gebrauchs, erfordern Neuausrichtung. </li><li> Befestigen Sie eine FC / PC zu FC / PC L-Winkel-Adapter mit dem Steckbrett. </li><li> Optional: Sichern Sie sich einen 1 x 2 50/50 Miniwürfel Faserteiler direkt auf dem Steckbrett für die gleichzeitige in vivo Stimulation von zwei oder mehr Tiere. Zusätzlich können Griffe zugegeben werden, um eine Bewegung der Lochrasteranordnung zu unterstützen (wie in 2A zu sehen ist). </li></ol> 2. Laser-Kopplung (Berührungslos-Klauenkupplung-) Dieser Abschnitt bezieht sich auf die Dual-Laser-Set-up (2B). Richten Sie die innere blaue Laser-Pfad vor dem Ausrichten die äußere gelbe Laserpfad. ! ACHTUNG: Verwenden Sie eine niedrige Lichtleistung Kopplung (~ 1 mW) auf Augensicherheit zu gewährleisten. Schutzbrille tragen, um das Gerät dem Laser und bis Lichtintensität gemessen und als sicher zu sein. <ol><li> Stellen Sie die Schalter auf der Rückseite des Lasers auf &quot;Curr&quot; (Strom) und Transistor-Transistor-Logik-Modus (TTL) + für konstante Beleuchtung (im Gegensatz zu Analog-Modus). Stellen Sie sicher, dass die Stromknopf auf der Vorderseite des Fahrers wird auf Null gesetzt. Einschalten des Lasers durch Einschalten des Treibers und dann die Lasertaste. </li><li> Langsam stellen Sie den Stromknopf auf der Vorderseite des Lasertreiber, so dass ~ 1 mW Laserlicht emittiert wird entfernt. Warten Sie 10 bis 15 Minuten (oder laut Herstellerangaben) für die Laser, um sich aufzuwärmen. </li><li> Schließen Sie das Glasfaserkabel Tester direkt an den free Ende der Kupplung Patchkabel und schalten Sie den Kabeltester (3A). Stellen Sie den Winkel des Kopplers, so daß der rote Strahl geradeaus fährt zurück in Richtung der Mitte des dichroitischen Spiegels. Der Strahlengang des roten Lichtes von der Kabeltester emittiert ist der genaue Weg, der die ankommende Laserlicht benötigen, um zu folgen, um in den Laser gekoppelt werden. </li><li> Führen Sie eine Grobausrichtung: Verwenden Sie die seitlichen und horizontalen Knöpfe an den kinematischen Spiegel, um den Strahl von Laserlicht in die Kupplung zu steuern. Die Sockelklemmen müssen möglicherweise gelockert, um etwas neu zu positionieren, die Spiegel und die Kupplung werden. Die kinematischen Halterungen sollten noch einige Reisen für weitere Feineinstellungen zur Verfügung. Seien Sie nicht beunruhigt, wenn kein blaues Licht wird von den Koppler angeschlossenen Patchkabel zu diesem Zeitpunkt ausgegeben. </li><li> Platzieren einer einzigen Stück halbdurchlässiges Papier unmittelbar vor dem dichroitischen Spiegel, zwischen dem dichroitischen Koppler und. Es wird sowohl eine blaue und ared Punkt auf diesem Papier aus dem Laser und dem Kabeltester auf. Verwenden Sie Papier, das lichtdurchlässig ist genug, um sowohl die roten und blauen Flecken gleichzeitig über dieselbe Seite des Papiers zu sehen. </li><li> Feineinstellungen für die erste Lenkspiegel (dh diejenige, die näher zu dem Laser, nicht der dichroitischen) durch vorsichtiges Einstellen der seitlichen und horizontalen Reglern die Mitte des roten Punktes mit den blauen Punkt auszurichten. </li><li> Bewegen des Papiers zurück in Richtung des Kopplers, so dass es direkt vor dem Koppler und die Regler auf der zweiten (dh dichroitischen) Spiegel, um den Laserstrahl mit dem roten Strahl auszurichten. </li><li> Durchlaufen Sie die Schritte 2.6 und 2.7, bis die Mitte der blau / gelben und roten Strahlen werden genau in beiden Positionen ausgerichtet (dh bis die roten und blauen Strahlen kollinear sind). </li><li> Entfernen Sie die Kabeltester vom Koppler Kabel. Laserlicht sollte jetzt vom Ende der Kupplung Patchkabel emittiert werden. </li><li> Bestimne Kopplungseffizienz durch die Messung der Lichtenergie von der Faserspitze der Kupplerpatchkabel mit einem Leistungsmesser emittiert. Verwenden Sie die 500 mW Einstellung auf Fotodiode des Power Meters und ändern Sie die Einstellung der Wellenlänge (λ) bis blau (473 nm) oder gelb (635 nm) Spektrumlicht in Abhängigkeit von der verwendeten Lasers. </li><li> Legen Sie die Faserspitze senkrecht zur Photodiode, eine Strommesswert zu erhalten. Vergleichen der Lichtleistung in die Koppler mit der Lichtleistung von dem Faserende ausgestrahlt wird. Eine Kopplungseffizienz von&gt; 80% wird als sehr gut. Sehr kleine weitere Anpassungen des zweiten Steuerspiegel kann manchmal etwas verbessern Kupplung. Im allgemeinen, wenn das Strahlenmuster von dem Ende des Kopplungsfaser ist eine kleine, enge, zentrale Stelle (ohne Ringe umgibt), die Kopplungseffizienz in den Faserkern ist optimal. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,1 bis 2,11 für Gelb Lasereinkopplung, außer mit den beiden Lenkspiegeln für die gelbe Laser (siehe 2C). Do not Stellen Sie die Position des dichroitischen Spiegels oder Ausrichtung des blauen Lasers verloren. </li></ol> 3. In vivo optogenetische Stimulation Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren, die Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den örtlichen und nationalen Richtlinien, die von der entsprechenden Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt und genehmigt. <ol><li> Optikfaseraufbau (siehe 3B zur Identifizierung der verschiedenen Arten von Patchkabeln im Folgenden). Zur Stimulierung einer einzelnen Maus, den Steckverbinder Patchkabel zu einer dicken Mantelpatchkabel mit dem FC / FC L-Winkel-Adapter direkt mit dem Steckbrett befestigt ist (siehe 4A). Um zwei Tiere von einem Laser anregen, den Steckverbinder Patchkabel an zwei dicken Mantelpatchkabel mit dem 1 x 2 50/50 Mini-Cube (siehe 4B). Um drei oder mehr Tiere zu stimulieren, schließen Sie das Kupplungskabel an eine Multimode-Faser-Splitter mit dem 1 x 2 mini-Cube bereits mit dem Steckbrett befestigt (siehe 4C). </li><li> Schließen Sie einen Umschalter / Drehgelenk mit den freien Enden der dicken Mantelpatchkabel / Faser-Splitter. Kommutatoren sind wichtig, da sie die Drehung der Faser mit der Nager Bewegung, die Anhäufung von Drehmoment auf die Patchkabel verhindert ermöglichen. Zu viel Drehmoment Kordeln drehen, führen zu Bruch, und stören die natürliche Bewegung des Tieres während des Tests. </li><li> Befestigen Sie das Tier-Patchkabel an den Kommutator. </li><li> Befestigen Sie eine Verbindungsspalthülse auf die freie Metallring Ende der Tierpatchkabel (Abbildung 5). Sie die Hülse nicht mit Gewalt den ganzen Weg bis die Hülse; verlassen ~ 0,5 cm der Hülse ausgesetzt als das ist, was eine Verbindung mit dem implantierten Glasfaser dem Tier befestigt (Figur 6). Critical Schritt: Immer Kauf Ärmel, die eine Spaltung enthalten, um Expansion der Hülse über implantiert Faserferrule während der Verbindung zu ermöglichen undEntfernung. Zu eng der Passung kann schwerem Trauma für das Tier führen, wenn sich das Implantat ablöst vom Schädel beim Versuch, die Hülse von dem Implantat zu trennen. Wenn dies auftritt, sollte das Tier aus der Studie entfernt werden und Sie erhalten sofortigen Tierarzt Pflege. In ähnlicher Weise, bevor Sie eine neue Hülse zum ersten Mal, &quot;brechen sie in &#39;durch Einstecken und Entfernen einer Hülse, bis sie mit der gewünschten Menge an Kraft trennt. Hinweis: Es ist einfach, einen Faserbruch beim Entfernen einer Hülse, die fest an einer Hülse befestigt ist. Um dies zu vermeiden, drücken Sie die Hülse aus, indem Sie einen kleinen Holzstab in das offene Ende der Hülse (der Griff eines Standard Wattestäbchen ist die richtige Größe). </li><li> Verbinden Sie den blauen Laser-Treiber an einen Impulsgenerator mit einem BNC-Kabel und schalten Sie das Aggregat auf. </li><li> Setzen Sie geeignete Schutzbrille auf. Die Schalter auf der Rückseite des Lasers und &quot;TTL +&quot; mode &quot;Curr&quot;. Stellen Sie sicher, that die Stromknopf auf der vor dem Fahrer auf Null gesetzt andturn der Laser (drehen Sie den Fahrer auf den ersten und dann den Laser-Taste). </li><li> Stellen Sie den Stromknopf auf der Vorderseite des Lasers, so dass 5 bis 10 mW ist gegen Tierpatchkabel Faserspitze emittiert wie unter Verwendung eines Lichtleistungsmesser. 5-10 mW ist eine allgemeine Richtlinie - die genaue Stromstärke erforderlich ist, um Auswirkungen auf ein gegebenes Gewebevolumen sollte vor Beginn des Experiments berechnet werden, wie in Aravanis et al 3. </li><li> Schalten Sie den blauen Laser in den Modus &quot;Analog&quot; für die in vivo-Stimulation. Hinweis: Yellow DPSS-Laser werden in TTL + Modus für konstante Beleuchtung betrieben. Warten Sie 10-15 Minuten für die der Laser, um sich aufzuwärmen. </li><li> Zurückhalten vorsichtig die Maus und schließen Sie das Split-Hülse auf dem Tierpatchkabel mit dem chronischen implantierbaren Faser (siehe Abbildung 6). Sicherstellen, dass die Enden beider Fasern physischen Kontakt miteinander stehen. Verwenden Sie den Split auf der Verbindungshülse alsFenster, um den direkten Kontakt zwischen den beiden Visualisierung kritischer Schritt. Manchmal Ablagerungen können auf dem Metallring von implantierbaren Faser des Tieres sammeln und stören die richtige Verbindung. In diesem Fall verwenden Sie ein Ethanol abwischen, um sanft reinigen Sie die Hülse auf den Kopf des Tieres vor der Anbringung. Niemals eine Verbindungsmuffe Kraft über die Hülse, da dies zu schweren Verletzungen des Tieres führen. Wenn eine physikalische Verbindung zwischen Faserenden können nach der Reinigung nicht gemacht werden, entfernen Sie das Tier aus der Studie. Tipp: Leichte Leckage an der Verbindungsstelle zwischen dem implantierten Fasern und Tierpatchkabel erfolgen. Visualisierung von diesem Licht durch Nagetiere können eine experimentelle verwechseln 10 zu präsentieren. Schrumpfschlauch kann an Patchkabel angebracht werden und glitt über den Verbindungspunkt von Fremdlicht zu minimieren. </li><li> Lassen Sie die Maus, um ein paar Minuten vor dem Beginn der Verhaltenstests zu gewinnen. Tipp: D* je nach Verhaltenstest verabreicht werden soll, ist es am besten, um Mäuse zu der Verbindungs- und Anbindungsprozess 2 habituate - 3 Tage vor, da die Handhabung erforderlich ist, um das Tier anschließen kann Stress induzieren und verwechseln Verhaltenstests. </li><li> Platzieren Sie die Maus in der Verhaltens-Testgerät sicherstellen, dass die Verbindungsschnur ist frei von Baumstümpfen. Lassen Sie niemals ein Tier unbeaufsichtigt während der Stimulation. Auch bei der Verwendung von Kollektoren, Patchkabel haben eine Tendenz, während der längere Zeit drehen und kann mit Verhaltenstests stören. </li><li> Verwenden Sie einen Impulsgenerator, um die blauen Laser mit einer bestimmten Frequenz, die Opsin der Wahl aktivieren pulsiert. Für gelbe Laser Verwendung: Puls der gelben Laser mit Außenjalousien oder einfach durch die Blockierung der Strahlengang mit einem undurchsichtigen, nicht reflektierenden, nicht brennbar Objekt. </li></ol> 4. Beitrag In vivo Stimulation Überlegungen Dieser Abschnitt ist nicht beabsichtigt, eine vollständige proto seincol, sondern als Leitlinien für weitere Verfahren, die folgenden in vivo optogenetische Stimulation berücksichtigt werden sollten, angeboten. <ol><li> Nach Beendigung des Experiments bestätigen viralen und Faserauflegekopf histologisch auf genaue Interpretation der Verhaltensergebnisse. Euthanize Tier gemäß gültiger Richtlinien und durchströmen das Tier mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 4% (w / v) Paraformaldehyd in PBS. </li><li> Entfernen implantierten Lichtwellen durch festes Ergreifen der freiliegenden Metallring mit einer Zange oder Hämostatika. Ziehen Sie in einer gleichmäßigen, aber schnell, Bewegung. Es ist wichtig, die Integrität der implantierten Faser durch Messen der Lichtleistung am Ende jedes Experiments getestet. </li><li> Post-fix die Gehirne in Para für mindestens 24 bis 48 Stunden vor dem Schneiden durch die interessierende Region. (Bei Verwendung eines Gefriermikrotoms, Inkubation Gehirne in einer 30% Saccharoselösung für mehrere Tage vor dem Schneiden). Führen Immunhistochemie mit standard Protokolle zum Nachweis der entsprechenden Opsin-tagged Fluorophore, also grün fluoreszierende Protein (GFP), gelb fluoreszierendem Protein verbessert (eYFP) oder mCherry. </li><li> Überprüfen Website von Opsin Ausdruck und Faser Implantat unter dem Mikroskop visuell geeignete Platzierung der Virusinjektion und Implantat auf Basis von ausgewählten Koordinaten bestätigen. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to report.

Die aktuellen beschriebenen Laseraufbauten und Tethering Strategien sind mit einer breiten Palette von Nagetier Verhaltenstests kompatibel. In der Tat, eine Vielzahl von Verhaltenstests wurden folgende verwendet worden oder begleitenden, um in vivo optogenetische Stimulation, emotionale Verhaltens Aufgaben, Verhaltensanlage, Lernen und Gedächtnis Paradigmen, Schlaf, Erregung und appetitive Aufgaben gehören einige zu nennen (siehe Nieh et al. 6 eine umfassende Überprüfung). Optogenetik hat sich verändert die Art und Weise traditionelle Verhaltenstests werden, dass mehrtägige Untersuchungen durchgeführt, kann jetzt in einer einzigen Sitzung, in der Verhalten gegen kondensiert werden, Innersubjekt, während verschiedene Epochen des Lichts &quot;auf&quot; versus &quot;off&quot; 5. Zu beachten ist, Verhaltens-Apparate, die Türen enthalten, geschlossene Fächer oder andere Hindernisse müssen möglicherweise geändert werden, um Durchgang der angebundenen Fasern unterzubringen. Die beschriebene Tethering Strategien Genehmigung sizeitigen Stimulation von mehreren Mäusen aus einem einzigen Laser. Hoher Durchsatz optogenetische Verhaltenstests kann somit durch die Verwendung mehrerer Laser und Prüfeinrichtungen erreicht werden. Die Zahl der Tiere, die gleichzeitig stimuliert werden können, wird jedoch durch die maximale Lichtleistung, die in jeder Faserspitze erreicht werden kann, begrenzt werden. Maximale Ausgangsleistung an der Faserspitze ist von der 1) Ausgangsleistung des Lasers; 2) die Kopplungseffizienz und 3) Anzahl von Strahl Splits. Für eine 100 mW blau Laser mit ~ 80% Kopplungseffizienz und bis zu 4 Strahl spaltet (wie in 4C dargestellt), Durchschnittsleistung an der Faserspitze kann zwischen 5-10 mW bei der Verwendung von 200 &amp; mgr; m-Kern, 0,22 NA Faser Patchkabel reichen (nb erwarten Transmissionsverlust von Drehverbindungen bis 15% &lt;). Messlichtleistung an der Faserspitze ist von wesentlicher Bedeutung für die Bestimmung ausreichende Lichtleistung für Opsin Aktivierung als Opsinen unterscheiden sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Licht und damit die Lichtleistungsdichte (mW/ Mm 2) für die Aktivierung 11 erforderlich. Zum Beispiel kann die stabile Sprungfunktions Opsin (SSFO) als ein Photon Akkumulator und benötigt daher nur sehr wenig Lichtleistungsdichte für die Aktivierung (&lt;8 uW / mm 2) 8. Vergleichen Sie dies mit den traditionellen Kanal Rhodopsin (ChR2), die ein Minimum von 1 mW / mm 2 Licht um Aktionspotentiale auslösen erfordert 2. Tabelle 1 ist als Kurzreferenz für bekannte erforderlich, um die am häufigsten Opsinen derzeit aktivieren minimale Lichtbestrahlungsstärken zur Verfügung gestellt verwenden. Schließlich muss man bedenken, dass die Licht streut und absorbiert, wie es durch Hirngewebe bewegt, so dass mehr Lichtleistung wird für tiefere Hirnstrukturen 3 erforderlich. Eine nützliche Online-Ressource finden Sie unter <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> dass die Lichtintensität in verschiedenen Tiefen durch Hirngewebe, indem sie in die Berechnung wirdKonto des Faserkerngröße, numerischen Apertur, der Wellenlänge des verwendeten Lichts, und das Ausgangslichtleistung an der Faserspitze. Für einen guten Überblick über die theoretischen Grundlagen zugrunde gelegten Berechnungen finden Foutz et al. (2012) 12. Beispiele dafür, wie diese Prinzipien und Berechnungen zur experimentellen Design gelten, sind in Aravanis et al (2007) 3 Tye et al. (2012) 13 gezeigt. Und. Durchführen dieser Berechnungen vor dem Beginn eines Experiments ist entscheidend, um eine ausreichende Lichtbestrahlung für Opsin Aktivierung sicherzustellen. Unter diesen Gesichtspunkten ist es vorteilhaft, eine höhere Leistungslasern erhältlich angemessene Leistung zu gewährleisten. Laser mit einer Leistung von 100-200 mW sind im allgemeinen ausreichend, um kleine Kern-Fasern, Mehrfaserspaltkopplungs Ineffizienz zu kompensieren und Übertragung verliert 7. Bei Verwendung von Hochleistungslasern jedoch darauf zu achten, die Nervenzellen Schaden oder Wärme und Licht-Mitarbeiter zu vermeidend Artefakte, die bei längerem und / oder Hochleistungs-Lichtbeleuchtung 7 auftreten können. Ein sicherer Bereich für in vivo-Experimente ist bis zu 75 mW / mm 2. 14 Die Entscheidung über die Art des Lasers erhältlich sind eine komplizierte Angelegenheit, da es viele Faktoren zu berücksichtigen sein. Zum Beispiel direkte Diodenlaser stabiler und wiederholbarer gepulste Ausgangs als dies diodengepumpter Festkörper- (DPSS) Laser und sind im Laufe der Zeit in einer Testumgebung, viel zuverlässiger. In einigen Fällen jedoch, Direkt Diodenlaser, eine niedrigere Lichtleistung, ~ 0,1 mW zu emittieren, selbst wenn die Steuerspannung 0 V aufgrund einer konstanten Vorstrom zu der Diode mit der Lasersteuerelektronik geschickt. Diese &quot;spontane&quot; Emissions hat ein breiteres Spektrum als tut Laseremission aus dem gleichen Laser, so kann gezielt durch den Einbau eines schmalen Bandpass (oder &quot;cleanup&quot;) Filter zwischen dem Laser und Koppler (siehe Teilliste) reduziert werden. Dieser Filter wird auchreduzieren Leistung von ca. 50% bei der Laser, so kaufen Sie eine höhere Leistungslaser entsprechend. Es sei darauf hingewiesen, dass Gelb DPSS-Laser sind extrem empfindlich und können fehlerhaft verhalten und haben die Lebensdauer verringert, wenn sich schnell von einem Impulsgeber moduliert werden. Einstellung der gelben Laserleistung sollte durch externe Dichtefilter Räder im Strahlengang (Abschnitt 1.7) angeordnet während des Betriebs des Lasers in TTL + Modus durchgeführt werden. Alternativ Kauf einer grünen 532 nm DPSS-Laser ist eine kostengünstige Alternative, die sowohl halorhodopsins und archaerhodopsins aktivieren können. Die numerische Apertur (NA) einer Faser ist wichtig, die bei der Gestaltung und Kauffaserkomponenten für die Laseranordnung Aufbaus. Die NA einer Lichtleitfaser bestimmt die Winkel der Lichtstrahlen, die akzeptiert und an der Spitze einer Faser emittiert werden kann. Wenn ein höherer NA Faser einer unteren NA Faser gepaart werden, erhebliche Verluste an dieser Grenzfläche auftritt, so ist es wichtig, eine konsistente wi sein<html> th Faser NA in einer Aufspannung (oder um sicherzustellen, dass die NA erhöht entlang des Lichtwegs). Die Wirkung der Faser NA auf das Volumen des Hirngewebes beleuchtet ist weniger wichtig, da Hirngewebe ist stark streuende und da das Licht von einer Laserquelle verbunden wird, um &quot;Unterfüllung&quot; Fasern mit großer NA neigen; jedoch optische Fasern mit einer NA von 0,22 und 0,37 sind weit verbreitet. In ähnlicher Weise koppelt von einem größeren auf einen kleineren Kernkernfaser wird auch zu erheblichen Verlusten führen, also immer sicher sein, zu erhöhen oder gleich einem Kerndurchmesser zu verwenden, wenn fortschreitend von der Laserquelle an das Tier Implantat. Allgemein kann festgehalten, sollten Faserenden immer verschlossen sein, wenn nicht in Gebrauch ist, um Staub und Partikel Stau zu vermeiden. Es ist eine gute Idee, regelmäßig zu reinigen Faserenden und Steckverbindungen (70% Isopropylalkohol funktioniert gut) bis zur maximalen Lichtleistung zu gewährleisten und Lichtleistung durch einen &quot;Dummy-Implantat&quot; vor Beginn jeden Tag der Experimente zu testen. &quot;&gt; In Verhaltenstests, zwingend notwendig, dass Maßnahmen ergriffen, um die Auswirkungen der Virusinfektion, exogene Proteinexpression, sichtbares Licht, und mögliche Gewebeerwärmungseffekte und Artefakte auf das Verhalten der Tiere zu kontrollieren ist. Daher ist die richtige Kontrollgruppe von Tieren bestehen mit einem Kontrollvirus transduziert (zB GFP, EYFP mCherry), die identische Lichtstimulationsparameter zu empfangen. Experimentelle Verifizierung ist eine entscheidende letzte Schritt, wie die Verhaltensdaten für die Analyse verwendet wird, ist vollständig abhängig von geeigneten Opsin und faseroptische Anordnung in der Region von Interesse . Insbesondere bei Tieren, wo keine immunhistochemische Signal erkannt wird, oder wenn die Platzierung des Signals oder Faser ist nicht in der interessierenden Region, so Verhaltensdaten für das Tier sollte aus dem Test entfernt werden. Außerdem ist es wichtig, um die Lichtleistung zu testen der Faserspitze, sowohl vor der chirurgischen Implantation wieder post-mortem, um eine ausreichende Lichtleistung für Opsin-Aktivierung zu gewährleisten. In animals denen starke Lichtverlust wurde durch die Faser nach dem Experiment aufgetreten ist (&gt; 30%) 9, sollten die Daten für dieses Tier zur Entfernung berücksichtigt werden. Kriterien für die Entfernung a priori festgelegt werden. Schließlich muß man die erforderlich ist, um neuronale Feuern zu modulieren Pulsfrequenz, die auf der Struktur des Gehirns und neuronaler Subtypen abhängen wird gezielt berücksichtigen. Veröffentlicht optogenetische Lichtstimulationsparameter existieren für mehrere neuronale Subtypen sollte jedoch die Fähigkeit, neuronale Feuern modulieren unabhängig voneinander durch in vivo oder Hirnschnittelektrophysiologischen Ableitungen bestätigt werden. Wie wird man geschickt mit Laser Verwendung und Modifizierung von Laseraufbauten können auch Kombinationen verschiedener Wellenlängen, um mehrere Fasern an einem einzigen Tier angebunden oder unten die gleiche Faser geliefert für die kombinatoOptoGenetik 8 werden. Multi-Wellenlängen-Stimulation wird immer wichtiger angesichts der rasanten Entwicklung der Rotverschiebunged Channelrhodopsinen 8, das Engineering von blauverschoben hyperpolarisierende Opsinen 15, die Verwendung von bistabilen Schritt-Funktion Opsinen 8,16,17, und die allgemeine Liste an Opsinen mit unterschiedlichen Aktivierungsspektren 11. Diese Erweiterung des optogenetische Toolbox wird die beispiellose Kontrolle über mehrere neuronale Subtypen sowohl innerhalb als auch zwischen Hirnregionen gestatten, ihre Rolle bei der Steuerung komplexer Verhaltenszustände bestimmen.

Optogenetik hat sich auf Systemebene Neurowissenschaften bei der Suche nach den neuronalen Schaltelemente Fahr normalen und krankheitsrelevanten Verhaltenszustände revolutioniert. Die Entdeckung, dass lichtempfindliche Mikroben Opsinen 1 könnte funktionell in Säugerzellen exprimiert werden, vorausgesetzt, die Plattform für den Einsatz von Licht, um eine beispiellose Kontrolle neuronaler Aktivität mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision 2 zu gewinnen. Im Gegensatz zu herkömmlichen elektrophysiologischen oder pharmakologische Ansätze zur Manipulation der neuronalen Aktivität, ermöglicht Optogenetik zur Kontrolle von spezifischen Zelltypen (basierend auf genetischen Identifizierung oder räumlichen Projektion) in heterogenen Populationen und bei physiologisch relevanten Zeitskalen. Die anschließende Einführung eines neuronalen-optische Schnittstelle ein praktisches Werkzeug für die Lieferung von Licht verhaltenden Tier 3. Dies hat für die Echtzeitmodulation definiert neuronale Schaltkreise in wach verhalten Nagetieren um kausal testen die erlaubtRolle der neuronalen Schaltkreise im Governance relevanten neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen 4-6 Verhaltenszustände. Optogenetik stellt daher ein leistungsfähiges Werkzeug für die Einführung in jedem Labor interessiert an der Untersuchung der funktionalen Zusammenhang zwischen Gehirnaktivität und Verhalten oder physiologische Messungen in Tiermodellen. Gelungenes Design und Fertigstellung eines optogenetische Experiment beinhaltet verschiedene Schritte und Überlegungen (siehe Abbildung 1). Das Ziel des derzeitigen Protokolls ist es, Personen mit den Werkzeugen und Komponenten zusammen mit der theoretischen und praktischen Kenntnisse notwendig, optogenetische Stimulation wach verhalten Nagetieren durchzuführen vorzusehen. Derzeit gibt es zwei zur mikrobiellen Opsin Kanäle aktivieren vorherrschenden Wellenlängenbereiche: im blauen Spektrum (üblicherweise 473 nm) und grün-gelb-Spektren (üblicherweise 532 oder 591 nm). Beide Laser und lichtemittierende Dioden (LEDs) als Lichtquellen verwendet werden, um deliver spezifische Wellenlängen des Lichts zum Hirngewebe. Die nicht-kohärentes Licht von LEDs emittierte macht jedoch effektive Übertragung von Licht schwierig, wenn die Kopplung in die für in vivo Nager Stimulation erforderlichen kleinen Kernfasern. Die Entscheidung über die geeignete Laseranordnung ist ein wichtiger erster Schritt, und wird von der beabsichtigten Verwendung der Optogenetik im Labor abhängen. Das aktuelle Protokoll beschreibt zwei grundlegende Konfigurationen, die in ihrer Einfachheit der Montage und Verwendung unterscheiden: Einzelvorgegekoppelten Lasern und Dual-Laser-Systemen (siehe Abbildung 2). Einzellasersysteme, die vom Hersteller vorge gekoppelt sind im Wesentlichen fertige gehen bei der Ankunft mit wenig bis gar keine Einrichtung erforderlich, haben aber den Nachteil, minimal Endbenutzer individuell gestalten. Ein Dual-Laser-System ermöglicht die Bereitstellung von zwei verschiedenen Wellenlängen auf der gleichen Faser. Dies wird zunehmend wichtig geworden mit dem Aufkommen von kombiOptoGenetik wobei verschiedene Wellenlängen verwendet werden, um zu aktivieren / zu hemmen bezeichnendesT-Zell-Typen, die räumlich co-lokalisiert sind. Dies ist auch für den Einsatz mit bistabilen Sprungfunktion Opsinen wo Photoströme initiiert und von blauem und gelbem Licht beendet bzw. 7,8. Dual-Lasersysteme sind auch kundengerecht, wie der Benutzer kann hinzufügen oder Komponenten (zB Außenjalousien, Strahlfilter, Inline-Stromversorgung Meter) aus dem Strahlengang zu entfernen, wie erforderlich. Aufgrund seiner Vielseitigkeit ist der Dual-Laser-Set-up zu empfehlen, wenn Optogenetik wird eine Fortsetzung Werkzeug im Labor verwendet werden. Die Kopplung der Laser kann jedoch eine Herausforderung darstellen und so eine schnelle, einfache und zuverlässige Kupplungsmechanismus wird in diesem Protokoll vorgesehen sind. Hinweis, dieses Protokoll beschreibt die Montage von optischen Komponenten und nutzt Rangierkabel und Komponenten, die bei Stufenindex-Multimodefasern mit einer 200 &amp; mgr; m-Kern und einer numerischen Apertur (NA) von 0,22 optimiert sind. Verschiedene Kerngrößen und NA sind käuflich zu erwerben, aber alle Komponenten sollten idealerweise in Bezug auf die Kern entsprechenGröße und NA Lichtverlust bei Faserverbindungsstellen zu vermeiden. Alternativ können bei einer Faserverbindung, Licht von einem kleineren zu einem größeren Kerngröße übergeben; und / oder von einem niedrigeren auf einen höheren NA-NA Faser ohne zusätzliche Verluste. Anbinden Strategien vorgesehen sind, die zur gleichzeitigen Stimulation von mehreren Mäusen für Hochdurchsatz-Verhaltenstests ermöglichen. Die zur Verfügung gestellten Protokolle annehmen Verwendung einer chronischen implantierbare Fasern für Verhaltenstests, sondern kann für akute Stimulationsprotokolle geändert werden. Akut implantierten Fasern sind zum Kombinieren optogenetische Stimulation mit pharmakologischen Manipulation vorteilhaft, da die gleiche Kanüle verwendet werden, um Medikamente und die Spitze einer optischen Faser auf die gleiche Stelle zu liefern. Die Verwendung von chronisch implantierten Fasern wird jedoch höchst für mehrere Tage Verhaltenstests zu empfehlen, da es reduziert Gewebeschädigung bei wiederholtem Einführen und Entfernen der Fasern zugeordnet ist, und erhöht die Genauigkeit in Bezug auf die einheitliche Anordnung der Fasern fürGewebe Beleuchtung 3. Wenn mit den hier beschriebenen Tethering Konfigurationen kombiniert werden, kann das Verhalten zuverlässig über mehrere Tage aufgenommen werden. In der Tat, zuverlässige Lichtdurchlässigkeit wurde berichtet Monate nach Faserimplantation 9, so dass chronische Stimulation und Verhaltenstests Paradigmen können theoretisch aus über mehrere Tage und Wochen durchgeführt werden. Zusätzliche Hinweise zur Hardware-Komponenten haben, um dem Protokoll hinzugefügt, um die Leserwahl in der besten Produkt, das ihren individuellen Bedürfnissen gerecht wird, auch kostengünstige Alternativen und Produkte, die im eigenen Haus gemacht werden können zu ermöglichen. Wichtige Tipps, die bei der Einrichtung und Durchführung nützlich sind, sind ebenfalls vorhanden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Mit in vivo optogenetische Stimulation erhalten Behavioral Ergebnisse sind völlig abhängig von neuronalen Schaltkreises gezielt, das Tiermodell verwendet, und die Modulationsparameter. Für aktuelle demonstrativen Zwecken Dopaminneuronen im ventral tegmentalen Bereich oder VTA, der Tyrosinhydroxylase :: Cre-Mäuse wurden mit einem stabilen Stufenfunktion Opsin (SSFO) 8 oder Kontrollvirus (eYFP) transduziert und eine Faser Implantat war chronisch implantiert. Die Verwendung von TH :: Cre transgenen Mäusen wird sichergestellt, dass Opsin Expression auf TH + -Zellen (Dopamin) im VTA beschränkt. 7 zeigt repräsentative Verwendung des aktuellen beschriebenen Laseraufbau zur gleichzeitigen Stimulation von mehreren Mäusen erhalten Verhaltensergebnisse. Hier wurden die Mäuse tethered und stimulierte gleichzeitig über separate Laser (3 Mäuse / Laser, wie in 4C) und Bewegungsverhalten wurde für 1 h aufgezeichnet. Wiederholte Stimulation der Dopamin-Neuronen im VTA führte zu einerhyper Phänotyp, während der Dauer des Stimulations anhielt. Keine Änderung der Bewegungsverhalten wurde in eYFP Mäusen beobachtet (siehe Video 1). Nach Verhaltenstests wurden durchgeführt, um die Immunhistochemie genaue Virus Targeting zu VTA Dopamin-Neuronen und Fiber-Placement wurde visuell bestätigt (siehe Abbildung 7) zu überprüfen. <img alt="Figur 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Versuchsschritte für in vivo optogenetische Stimulation. Es gibt vier allgemeine Schritte involviert bei der Planung und Durchführung von in vivo optogenetische Stimulation. Dieses Protokoll spezifisch werden die Schritte bei der Bereitstellung von Licht von einer Laserlichtquelle, um tiefe Gehirnstrukturen in den Verhaltensweisen Nagetier beteiligt und umfasst 1) Lasersystem Montage und Lichtkopplung; 2) Anbindung Strategien für ceinen Schritt, die für die Interpretation der Daten ist - nschluss mehrere Tiere auf eine Lichtquelle für die Hochdurchsatz-Verhaltenstests und 3) enthält Richtlinien des Targeting Strategie zur Lichtabgabe bestätigen. Hinweis: Obwohl dieses Protokoll ist nicht exklusiv zu chronischen implantierbare Fasern für Tethering Zwecke, wird empfohlen und angenommen, wenn die Kombination von optogenetische Stimulation mit Verhaltenstests. Siehe auch Ung &amp; Arenkiel 2012 18 und Sparta et al., 2012 9 für die Eigenfertigung und die Implantation von chronischen Lichtwellenleiter. Durchgezogene Linien = Schritte in diesem Protokoll abgedeckt. <img alt="Abbildung 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Lasersysteme für die In-vivo-optogenetische Stimulation verwendet. (A) Einzellasersystem für die In-vivo-Stimulation. Dieser Laser ist ph<html> Nach Hersteller ysically vor, gekoppelt und benötigt wenig Endbenutzer Set-up. (B) Dual-Lasersystem. Zwei Laser werden in einer einzelnen Faser durch die Verwendung von Spiegeln, die auf jedem Strahlengang in einen berührungslosen Art Koppler lenken handeln gekoppelt. Dies ist das vielseitigste Set-up als optische Komponenten können entfernt oder hinzugefügt, wie gebraucht, aber stellt eine größere Herausforderung in Bezug auf die effiziente Laserkopplung werden. (C) Schematische Darstellung der in (B) gezeigt, Dual-Laser-System angibt, Platzierung von Laser und Spiegel mit der entsprechenden Laserlicht-Strahlengang (Pfeile) dargestellt. Hier der dichroitische Spiegel &quot;D&quot; wird verwendet, um blauen Wellenlängen des Lichts abzulenken beim Senden gelben Wellenlängen durch, um den Koppler &quot;C&quot; und in den angeschlossenen Koppler-Patchkabel. B = blauer Laser; C = berührungslosen Stil Koppler; D = dichroitischen Spiegel; FW = Filterscheibe; M = Spiegel; Y = gelb Laser.bekommen = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Figur 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. (A) Kabeltester in der nicht-physischen Kupplungsprotokolls verwendet. Unten: Kabeltester direkt an einem Patchkabel verbunden. Zeigt Insert Verbindungspunkt des Testers zu Kabel (B) Patchkabel in der gesamten Protokoll bezeichnet Von außen nach innen:.. Multimode-Faser-Splitter, schwarz Manteltier-Patchkabel mit weißen Zirkonia Spalthülse auf die Flach spalten befestigt (FC) Ende, dicken Mantelpatchkabel (auch als &quot;Koppler Kabel&quot; bezeichnet). Dick Mantel Patchkabel sind mit Polyvinylchlorid (PVC) Schläuche für zusätzlichen Schutz beschichtet. Für diese Kabel sind Industriestandard-Farbcodes verwendet werden, um zwischen verschiedenen Fasertypen, wobei orange = Multimode-Faser zu unterscheiden. Tierpatchkabel sind<html> dünnere Mantel während Verhaltenstests Flexibilität für die Tierbewegung ermöglichen. Beachten Sie, dass Staub / PC endet Kappen auf FC gesetzt, wenn Kabel nicht in Gebrauch sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Tethering Strategien für In-vivo-optogenetische Stimulation von (A) einem einzigen Tier, (B) zwei Tiere; . (C) drei oder vier Tiere Mögliche Konfigurationen sind nicht auf die oben gezeigten beschränkt - mehrere Konfigurationen sind durch die einzigartige Kombination von Adaptern, Faserteiler und Verzweigung Patchkabel, die im Handel oder mit kundenspezifischen Auftrag vorhanden sind möglich. Hinweis: Patchkabel und Glasfaser-Splitter enthalten FC / PC Steckern an beiden Enden (nur ein Ende dargestellt).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. Richtige und falsche (rot x) Anschluss eines Patchkabel mit einer implantierbaren Lichtwellen mit einem Split-Ärmel. (Linkes Feld) Zirkondioxid-split-Hülse verwendet wird, um ein Patchkabel mit dem Ring eines implantierbaren LWL (hier nicht gezeigt, um ein Tier anzubringen) verbinden. Pfeil ist mit dem Verbindungspunkt zwischen der Patchkabel und implantierbare LWL zeigt. Vergleichen Sie (rechts), wo ein Spalt zwischen der Patchkabel und implantierbare Glasfaser-, wie durch die Spaltung der Verbindungshülse visualisiert. Notieren Sie sich den Lichtverlust, der mit einem unsachgemäßen Anschluss (unten rechts) auftreten können. Bodeneinsatz auf upper linke Tafel zeigt verwendeten Einzelkomponenten. Von oben nach unten des Einsatzes: Doric implantierbare Glasfaser-Kanüle, weißen Zirkonia Split-Ärmel, Flach cleeve (FC) Ende eines schwarzen Manteltier-Patchkabel (in 3B dargestellt vollen Patchkabel). In allen Platten, beachten Sie, dass die Verbindungshülse ist nicht bündig mit dem FC Ende des Patchkabels. Lassen ~ 0,5 cm von einer Über hängen zum Anschluss an das implantierbare Lichtwellen dem Tier angebracht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Abbildung 6. Seite (links) und frontal (rechts) Ansicht einer Maus mit einem implantierten Faseroptik zu einem Patchkabel verbunden ist. Mit dem Split auf der Verbindungshülse zu helfen visualisieren richtige Verbindung des Patchkabels to der Zwinge des implantierten Glasfaser. Der Anschlusspunkt wird durch einen roten gestrichelten Box hervorgehoben und auch im oberen Einsatz dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Abbildung 7. Repräsentative Ergebnisse. (Links) Behavioral Auslesen von in vivo optogenetische Stimulation. Beispiel für das Verhalten, die mit der beschriebenen Laser Aufbau und Anbinden Protokoll erhalten werden können. Entweder mit einer Stufenfunktion Opsin (AAV5-DIO-SSFO-eYFP transduziert - lokomotorische Aktivität wurde während optogenetische Stimulation des ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in Tyrosinhydroxylase (TH) :: Cre-Mäusen (8 / Gruppe n = 7) aufgenommenen ) oder Kontrollvirus (AAV5-DIO-eYFP) in der VTA. Gruppen von drei Mäusen wurden gleichzeitig zu einer einzigen bundenLaser, wie in 4C dargestellt ist und mit einer 5 sec Impuls von 447 oder 473 nm Licht angeregt einmal geliefert alle 15 min. Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen zeigten eine signifikante Gruppe x Zeit Interaktion (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001), und einen signifikanten Haupteffekt von der Zeit (F 3,39 = 4,67, p = 0,007), wobei optogenetische Stimulation erhöhte lokomotorische Aktivität nur in SSFO Mäusen (Bonferroni post hoc p &lt;0,0001, bezogen auf t = 0 - 15 Zeit bin), was zu einem Gesamtanstieg in der Bewegungsaktivität, verglichen mit eYFP Mäusen (Hauptwirkung der Gruppe: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p &lt;0,01 bei t = 15 bis 30 und p &lt;0,001 bei t = 30 bis 45 und t = 45 - 60). Fiber-Spezifikationen: 200 &amp; mgr; m-Kern, 0,22 NA. Lichtbestrahlungs = 6-66 mW / mm 2, entsprechend Faserspitzenabstand von 0,1 bis 0,6 mm aus viralen Injektionsstelle mit 5 mW Lichtleistung am Faserende vor dem Anbinden emittiert. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts. eYFPvs. SSFO: ** p &lt;0,01; *** P &lt;0.001; Zeitwirkung: #### p &lt;0,0001 (rechts) histologische Sicherung von viralen und Glasfaser-Platzierung.. Konfokalen Fluoreszenzbild auf einem Leica TCS SP5 Scanning-Laser-Mikroskop aufgenommen wurde verwendet, um Fiber Placement (gepunktete Linie) und viral-vermittelte Expression (grün) in der Maus ventralen Tegmentum folgenden in vivo optogenetische Stimulation zu visualisieren. Dopamin-Neuronen (TH +) sind blau gesehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Video 1. In vivo optogenetische Stimulation. Hyperaktivität bei VTA Stimulation mit SSFO in TH :: Cre Mäusen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsStimulations = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tabelle 1 Lichtbestrahlungsstärken erforderlich, um häufig verwendete Opsinen aktivieren. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> Leistungsdichte (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Immobilien </td></tr><tr><td> On / Off Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Optische Anregung: Schnell wirkende Channelrhodopsinen </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5 mW </td><td> 1.21 / 12 msec </td><td> Feuer bis zu 40 Hz </td></tr><tr><td> Cheta 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 ms </td><td> Feuer bis zu 200 Hz </td></tr><tr><td> Chef 20 </td><td> 450 </td><td> 1,65 mW </td><td> 1.62 / 12 msec </td><td> Nicht Desensibilisierung Form ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm) </td><td> 5/34 ms bei 540 nm </td><td rowspan="2"> Rotverschoben </td></tr><tr><td> 3,2 mW (630 nm) </td><td> 67 msec (on) bei 630 nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Optische Anregung: Langsam wirkende Kanal Rhodopsine </td></tr><tr><td> Stabile Sprungfunktion Opsin (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 &amp; mgr; W (470 nm) </td><td> 20 ms / 29 min </td><td> New SFO Variante; mehr geöffneten Zustand. Eröffnet von 470 nm, von 590 nm geschlossen </td></tr><tr><td colspan="4"> Optische Inhibition </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2,5 ms / &lt;10 msec </td><td> Anhalt Hemmung 30 min 22 mit Konstantlicht * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msec </td><td> Empfindlicher mit größeren Photoströme als eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Diese Tabelle ist als nur eine Führung vorgesehen ist; spezifisch für neuronale Modulation erforderliche Lichtbestrahlungsstärken sollte unabhängig bestätigt werden. </td></tr><tr><td colspan="5"> Experimentelle Validierung ist wichtig zu überprüfen, ob das Opsin, Targeting Strategie und Lichtstimulationsparameter zu modulieren neuronale Feuern in der vorgesehenen Art und Weise 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> Leistungsdichte (mW / mm 2) bezieht sich auf die Leistung von Licht in einem bestimmten Bereich des Hirngewebes beleuchtet und nicht an Lichtenergie von der Faserspitze emittiert beziehen. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Verwenden Sie immer den niedrigsten Lichtintensität möglich, vor allem bei längerer Lichtstimulation. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Lichtbestrahlungsstärken erforderlich, um häufig verwendete Opsinen aktivieren. Abkürzungen AAV = adeno-assoziierten Virus DPSS = diodengepumpten Festkörper <br/&gt; EYFP = verbesserte gelb fluoreszierende Protein FC / PC = Flach spalten / Körperkontakt GFP = grün fluoreszierende Protein PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung PVC = Polyvinylchlorid mW = Milliwatt NA = numerische Apertur SSFO = stabil Schritt-Funktion Opsin TH = Tyrosinhydroxylase TTL = Transistor-Transistor-Logik V = Spannung VTA = ventralen Tegmentum

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

59.0K Aufrufe.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Serie: In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...