Wir beschreiben hier einen einfachen OpenSource-Workflow auf Fidschi-Basis namens Worm-align, der verwendet werden kann, um Einzel- oder Mehrkanalmontagen von begradigten Würmern von Interesse aus rohen Mikroskopiebildern zu erzeugen. Da dieser Workflow von vom Benutzer ausgewählten Tieren von Interesse abhängt, kann dies besonders nützlich sein, wenn Bilder von C.elegans analysiert werden, bei denen sich die Würmer nicht alle im richtigen Stadium oder Zustand befinden. Es sollte beachtet werden, dass die Ausgabe von Worm-align für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenz mit Fidschi oder einer anderen Bildanalysesoftware verwendet werden kann.
Hier demonstrieren wir die Fluoreszenzquantifikation mit der CellProfiler-Pipeline Worm_CP. Beginnen Sie mit der Erstellung einer Mundmikropipette, indem Sie eine dünne Glaskapillare in der Flamme eines Bunsenbrenners ausdehnen. Nach verlängerung in der Flamme, brechen Sie die Kapillare in zwei Stücke, wenn es nicht in zwei Stücke nach verlängerung brechen.
Wenn es in zwei Stücke zerbrach, schneiden Sie das Ende des längsten. Wählen Sie das längere Stück aus und testen Sie, ob die Kapillare offen ist, indem Sie versuchen, Wasser zu saugen. Lösen Sie den Adapter von einem drei Millimeter silikonrohr.
Stecken Sie die Glaskapillare in einen Kapillaradapter, der mit einem sechs Millimeter langen Silikonrohr verbunden ist. Dann das andere Ende des Sechs-Millimeter-Rohres in einen 0,2-Mikrometer-Filter und ein Drei-Millimeter-Silikonrohr am anderen Ende stecken. Stecken Sie eine ein Millimeter Filterspitze in das freie Ende des drei Millimeter großen Silikonrohrs, um Flüssigkeit zu saugen.
Entfernen Sie unter einem Seziermikroskop so viel Flüssigkeit wie möglich um ein Pellet fester Würmer mit der Mundmikropipette. Fügen Sie schnell 10 Mikroliter Montagemedium an der Unterseite des Rohres hinzu. Spülen Sie eine 10-Mikroliter-Spitze in PBS mit Spuren von Reinigungsmittel, um zu verhindern, dass Würmer an den Seiten der Kunststoff-Pipettespitze kleben.
Dann schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer Schere. Acht Mikroliter Montagemedium mit den Würmern auf ein zuvor vorbereitetes Agarosepad übertragen. Während Sie den Schlitten unter dem Mikroskop beobachten, rühren Sie ihn sanft auf, um Überlappungen der Würmer zu vermeiden.
Dann bedecken Sie den Tropfen des Montagemediums auf dem Agarose-Pad mit einem 18 mal 18 Millimeter-Deckel. Um lebende Würmer zu montieren, löst sich Pipette drei bis vier Mikroliter von drei Millimolar-Levamisol in M9 auf ein Agarose-Pad. Wählen Sie 30 bis 50 Würmer pro Zustand in den Tropfen Levamisol.
Dann bedecken Sie den Tropfen mit einem 18 mal 18 Millimeter-Coverslip und bedecken Sie die Würmer innerhalb einer Stunde. Installieren Sie das Open-Source-Image-Analyse-Softwarepaket Fiji von ImageJ, oder wenn es bereits auf dem Computer installiert ist, überprüfen Sie, ob es Version 1.52A oder höher ist, laden Sie dann das Worm-Align-Repository von GitHub herunter und speichern Es auf dem Computer. Sobald alle Pipeline-Komponenten heruntergeladen und installiert wurden, öffnen Sie Fidschi und führen Sie das Worm-Align-Makro aus, indem Sie auf Plugins, Makros klicken und in der Hauptmenüleiste ausgeführt werden.
Suchen Sie die Wurmausrichtung. ijm-Skript und klicken Sie auf öffnen. Navigieren Sie zum Eingabeordner mit den zu analysierenden Bildern, und klicken Sie auf Auswählen, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Ordner nur Bilddateien enthält.
Das Makro generiert automatisch einen Ausgabeordner, in dem alle Ergebnisse gespeichert werden. Der Name des Ordners entspricht dem Eingabeordner mit der Ausgabe als Post-Fix. Erlauben Sie dem Makro, das erste Bild im Eingabeordner zu öffnen, und verwenden Sie es als repräsentatives Bild, um die Einstellungen zu extrahieren, die zum Generieren der Montage erforderlich sind, einschließlich der Breite der Würmer, der Helligkeit und des Kontrasts.
Zeichnen Sie mit dem geraden Zeichenwerkzeug eine Linie über die Breite eines Wurms, und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie die Länge dieser Linie, um die Höhe der zugeschnittenen Bereiche für einzelne Würmer zu bestimmen. Geben Sie für jeden Kanal den Namen, die Nachsuchtabelle und ob er in die Montage einbezogen werden soll, und klicken Sie dann auf OK. Passen Sie als Nächstes die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen für die Kanäle mit den Schiebereglern an. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Kanäle.
Sobald alle Einstellungen konfiguriert sind, werden sie in einer Einstellungstabelle aufgezeichnet und im CellProfiler-Unterordner des Ausgabeordners gespeichert. Ein Bild wird generiert, um zu zeigen, wie alle Bilder nach der Anwendung der Einstellungen aussehen. Wenn das Bild zufriedenstellend ist, kreuzen Sie das obere Kästchen an.
Das zweite und dritte Kästchen des Kontrollkästchens alle Einstellungen geben die Optionen für die Montagegenerierung an. Lassen Sie beide Kästchen angekreuzt, und klicken Sie auf OK, um den Rest des Makros auszuführen. Wenn Sie das obere Kästchen nicht ankreuzen, führt das Makro dazu, dass das Setup erneut ausgeführt wird.
Das Makro öffnet dann alle Bilder im Eingabeordner. Zeichnen Sie für jedes Bild Linien auf der Längsachse aller Würmer, die mit dem segmentierten oder dem Freihandlinienwerkzeug in die Montage einbezogen werden sollen. Zeichnen Sie Linien konsistent von Kopf zu Schwanz oder umgekehrt entlang der gesamten Länge der Würmer und fügen Sie jede Linie zum ROI-Manager hinzu, indem Sie auf Control T klicken. Sobald alle gewünschten Würmer hinzugefügt wurden, klicken Sie auf OK. Worm-align generiert dann zugeschnittene Bilder einzelner ausgewählter Würmer, die im einzelnen Wurmunterordner des Ausgabeordners gespeichert werden.
Montagen aller ausgewählten Würmer werden im ausgerichteten Ordner gespeichert. Laden Sie CellProfiler 2.2.0 herunter und installieren Sie es, indem Sie auf den Link für frühere CellProfiler-Versionen auf der Download-Seite klicken und das gewünschte Betriebssystem auswählen. Stellen Sie vor dem Starten der Worm_CP Pipeline sicher, dass alle erwarteten Ausgabebilder im CellProfiler-Unterordner des Wurm-Align-Ausgabeordners vorhanden sind.
Eine verarbeitete Kopie des Originalbildes, eine binäre Bildmaske der Wurmpopulation, ausrichten Maske, wenn die Linie auf ausgewählten Würmern gezeichnet wird und ein Bild, das jeden der Kanäle im Originalbild darstellt, vorhanden sein sollte. Öffnen Sie CellProfiler, klicken Sie dann auf das Bildeingabemodul und ziehen Sie den CellProfiler-Modulordner in das Fenster, das hier Drop-Dateien und Ordner angibt. Wenn eine Liste von Bildern aus einer früheren Analyse vorhanden ist, entfernen Sie diese zuerst, indem Sie mit der rechten Maustaste in das Fenster klicken und die Dateiliste löschen.
Klicken Sie auf das Metadateneingabemodul und auf die zweite Extraktionsmethode, klicken Sie auf den gelben Ordner und navigieren Sie zum CellProfiler-Unterordner des Worm-Align-Ausgabeordners. Wählen Sie die Einstellungsdatei aus, und klicken Sie dann auf Aktualisieren. Klicken Sie als Nächstes auf das Eingabemodul für Namen und Typen, und stellen Sie sicher, dass alle für die Pipeline erforderlichen Bilder vorhanden sind.
Wählen Sie vor dem Ausführen der Pipeline ein Ziel für die Ausgabeergebnisse im Ausgabemodul aus. Verwenden Sie den Testmodus, um zu sehen, wie die Pipeline funktioniert, indem Sie auf den Testmodus starten klicken und es zulassen, dass sie durch das erste Bild im Ordner ausgeführt wird. Wenn Sie mit der Leistung der Pipeline zufrieden sind, klicken Sie auf Testmodus beenden und Bilder analysieren.
Stellen Sie vor Beginn der Analyse sicher, dass alle Augen vor dem Analysemodul geschlossen sind. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, öffnen Sie den Worm_CP Ausgabeordner, der aus zwei CSV-Dateien, Würmern CSV und Zeilen CSV besteht. Die Kultivierung und Abbildung von C.elegans nach der in diesem Protokoll beschriebenen Methode erzeugt große Übersichtsbilder von Wurmpopulationen.
Die Ausgabe der Pipeline hängt weitgehend von der Qualität der Linien ab, die über den Bildern gezeichnet werden. Hier werden mehrere Linienbeispiele und deren Ausgabe aus Worm-align gezeigt. Bei Verwendung des Worm-Align-Skripts ist eine visuelle Identifizierung von sich schneidenden Würmern aus den Overlay-Bildern im Datenunterordner sowie aus den Panels einzelner Würmer in der Montage möglich.
Die QC-Tabelle kann auch verwendet werden, um überlappende Würmer zu identifizieren. Das Schneiden von Leitungen ist jedoch für die Worm_CP Pipeline problematisch. Dies liegt daran, dass Worm_CP Linienmaske und nicht Interessenbereiche verwendet, um einzelne Würmer zu identifizieren.
Daher segmentieren CellProfiler einen der Würmer als zwei Objekte. Die Worm_CP-Pipeline wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von festen Tieren zu quantifizieren, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet sind, der in Lipidtröpfchen einbaut. Der Fetttröpfchengehalt wird durch manuelle Quantifizierung um 17 % zwischen Wildtyp und mutierten DBL1-Tieren und mit hilfe der Worm_CP-Pipeline um 12 % verringert.
Worm_CP wurde auch verwendet, um die Hitzeschock-Reaktion bei lebenden Würmern zu quantifizieren, die GFP unter Kontrolle eines hitzeschockinduzierbaren Gens ausdrücken. In Ermangelung von Hitzestress induzierten die Würmer keine GFP-Expression. Wenn die Würmer als kurzer Hitzeschock ausgesetzt werden, wird die GFP-Expression induziert.
Die Ausgabe von Worm_CP hängt weitgehend von der Qualität der Linien ab, die Sie mit Worm-Align zeichnen. Stellen Sie sicher, dass sich Ihre Linien nicht berühren oder überlappen, und zeichnen Sie alle Linien in die gleiche Richtung. Wenn Sie die QC-Tabelle überprüfen, können Sie Linien identifizieren, die sich berühren oder überlappen, sodass Sie diese Fälle aus der Analyse ausschließen können.
Die Ausgabe von Worm-align kann für die nachfolgende Quantifizierung entweder in Fidschi oder in anderen Bildanalyse-Softwarepaketen verwendet werden. Wir haben hier eine sehr einfache CellProfiler-Pipeline gezeigt, in die sehr einfach andere Analysemodule integriert werden könnten, um beispielsweise die Anzahl der Lipidtröpfchen zu zählen oder die Intensität einzelner Tröpfchen innerhalb eines Wurms zu quantifizieren. Einer der Vorteile dieser Technik ist die Möglichkeit, die Fluoreszenz von einzelnen Würmern schnell zu quantifizieren.
In unserem Labor haben wir ein Interesse an individueller Lebensfähigkeit mit Fluoreszenzreportern und verwenden dafür routinemäßig Wurm-Align- und Worm_CP.
