Die C.elegans embryogenese dauert etwa 13 Stunden und wird in der Regel durch Das Filmen eines Embryos nach dem anderen überwacht. Unser Protokoll ermöglicht jedoch die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung von 80 bis 100 Embryonen. Die Möglichkeit, Daten für eine große Anzahl von sich entwickelnden C.elegans-Embryonen zu sammeln, eröffnet eine neue Reihe von Experimenten, einschließlich der quantitativen Analyse von Entwicklungsereignissen und Großbildschirmen.
Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um verschiedene Entwicklungsprozesse zu erfassen oder Embryonen abzubilden, die eine beliebige Kombination von Markern in geweben von Interesse ausdrücken. Es ist eine Herausforderung, die Embryonen in den Brunnen richtig zu zerstreuen. Sie sollten dicht beieinander liegen, um die Erfassung mehrerer Embryonen pro Feld zu ermöglichen, ohne in verschiedenen Z-Ebenen zu verklumpen.
Wir empfehlen, zwei Forscher für die Seitenzerlegung, auf Eis und das Absperren ungenutzter Brunnen zu verwenden. Wir werden auch einige nützliche Tricks zeigen, um schnell eine gut inszenierte 384-Well-Platte einzurichten. Beginnen Sie mit dem Abdichten einer 384-Well-Platte mit PCR-Klebefolie, um ungenutzte Brunnen zu maskieren.
Verwenden Sie ein Rasiermesser oder Skalpell, um die Folie zu schneiden, um eine Teilmenge der Brunnen für den Einsatz freizulegen. 70 Mikroliter frisch zubereiteten TMHC in jeden Brunnen geben und die Platte auf Eis halten. Schließen Sie die äußeren beiden Reihen der Platte aus, um Kanteneffekte zu verhindern.
Für eine schnelle Probenvorbereitung wird eine Seiten-an-Seite-Sektion von zwei Forschern empfohlen. Wenn die gesamte Lösung plattiert ist, verwenden Sie eine feine Pinzette und ein Seziermikroskop, um etwa 10 gravid Erwachsene in 150 Mikroliter eiskalter TMHC-Lösung innerhalb eines Depressionsschlittens pro Zustand zu übertragen. Mit der Pinzette und einem Skalpell sezieren Sie die Würmer, um die Embryonen freizusetzen und eine gezogene Kapillarpipette in einen Mundsauger zu laden.
Verwenden Sie die Mundpipette, um alle zwei- bis achtzelligen Stadium-Embryonen in einzelne Brunnen der vorbereiteten Platte zu übertragen und die Platte zu untersuchen, um zu bestätigen, dass keine Aggregate in irgendwelchen Brunnen vorhanden sind. Wenn alle Embryonen gesammelt wurden, legen Sie die Proben durch Zentrifugation ab und verwenden Sie ein mit Ethanol getränktes Tuch, um Rückstände vom Boden der Platte zu entfernen. Legen Sie die Platte in den Plattenhalter eines konfokalen Mikroskops, das mit einer temperaturgeregelten Umgebung ausgestattet ist, und verwenden Sie das 10X-Objektiv, um einen Vorscan jedes Brunnens durchzuführen, um Felder mit geeigneten Embryonen zu identifizieren.
Wechseln Sie am Ende des Scans zum 60X-Objektiv, passen Sie die Brennebene an jedem Punkt auf Bild eins bis vier Felder pro Bohrwert an und erfassen Sie 18 Z-Abschnitte in zwei Mikrometerintervallen alle 20 Minuten für 10 Stunden. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, führen Sie einen niedrigen, ganzen, gut hellen Feldscan durch, etwa 20 bis 24 Stunden nach Dem Beginn der nächtlichen Bildgebung, um die embryonale Letalität zu bewerten. Für das automatisierte Zuschneiden mit embryoCropUI ausführbar, laden Sie zuerst das Programm von Zenodo und die Testdateien.
, um festzustellen, ob das Programm auf der Plattform ordnungsgemäß funktioniert. Nach dem Herunterladen entpacken und navigieren Sie, um die ausführbare Datei embryoCropUI zu finden, und doppelklicken Sie, um das Programm zu starten. Wählen Sie öffnen aus, um das erste spezifische 4D-Ansichtsfeld zum Zuschneiden zu laden.
Wenn Sie eine TIFF-Serie mit mehreren Dimensionen zuschneiden, laden Sie nur das erste Bild der Serie innerhalb des Ordners. Wenn alle Bilder geladen wurden, geben Sie die Bildparameter an, wählen Sie Die Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur aus, und legen Sie die Reihenfolge der Bildsammlung und die Mikrometer pro Pixel fest. Wählen Sie dann ausführen aus, ein neuer Zuschneidewert mit der Bezeichnung "Unterordner" wird im gleichen Pfad wie der nicht zugeschnittene Ordner erstellt, und die zugeschnittenen Versionen werden an diesem Speicherort gespeichert.
Für die Visualisierung, laden Sie die offene und kombinierte MSV2 ImageJ Plugin und grafische BenutzeroberflächenAnweisungen Zenodorepov2. docx von Zenodo und öffnen Sie das Plugin in IMageJ. Suchen Sie die Zeilen drei und vier, und geben Sie den Speicherort ein, an dem die Bildordner nach dem Zuschneiden gespeichert werden.
Die Bildordnernamen der zu verarbeitenden Bedingungen und der eindeutige alphanumerische Bezeichner für jedes Nachtexperiment. Wenn alle Informationen eingegeben wurden, klicken Sie auf Ausführen. Es wird ein Fenster angezeigt, das eine Aufforderung zum Navigieren in den äußeren Ordner mit den zugeschnittenen Bildordnern startet.
Sobald ausgewählt, wird ein anderes Fenster angezeigt, das die Angabe der Bildparameter ermöglicht. Klicken Sie auf okay. Die zusammengesetzte Datei beginnt mit der Montage.
Wenn der Verbund generiert wurde, überprüfen Sie die geöffneten Dateien. In Verbindung mit benutzerdefinierten Reporterstämmen werden informative Auslesungen für die meisten wichtigen Entwicklungsereignisse angezeigt. Einschließlich Sulfatspezifikation, dorsale Interkalation, epidermale skalianische skalianische, Dehnung und Neurogenese.
24 Stunden nach der Injektion ist ein optimaler Zeitpunkt für die Bildgebung. Ab diesem Zeitpunkt sind die erschöpfung des mütterlichen Proteins und die Hemmung der zygotischen Genexpression wirksam und liefern unterschiedliche, hoch reproduzierbare Signatur-Phänotypen über ein breites Spektrum von Genen, die an der Sulfatspezifikation und Morphogenese beteiligt sind. Es ist wichtig, während der Sezieren und Embryo-Selektionsschritte geduldig zu sein.
Die Minimierung des Klumpens und die Auswahl der geeigneten Brennebenen sind ebenfalls unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten. Unser Protokoll kann mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Markerstämmen und in Kombination mit RNAi oder Mutanten durchgeführt werden. Unsere Verarbeitungswerkzeuge ermöglichen eine optimierte, automatisierte oder manuelle Datenanalyse.
Mit den hier beschriebenen Stämmen, Methoden und Werkzeugen führte unsere Gruppe einen RNAi-basierten Bildschirm mit hohem Gehalt durch, der auf etwa 2 000 Gene abzielte, die für die embryonale Entwicklung benötigt wurden. Für dieses Projekt waren halbhohe Durchsatzmethoden unerlässlich.
