Descrevemos aqui um simples fluxo de trabalho baseado em Fiji chamado Worm-align, que pode ser usado para gerar montagens únicas ou multicanais de worms endireitados de interesse a partir de imagens de microscopia bruta. Como este fluxo de trabalho depende de animais selecionados pelo usuário de interesse, pode ser particularmente útil ao analisar imagens de C.elegans onde os worms não estão todos no estágio ou condição corretas. Deve-se notar que a saída de Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente de fluorescência com Fiji ou outro software de análise de imagem.
Aqui demonstramos quantificação de fluorescência usando o pipeline CellProfiler Worm_CP. Comece criando uma micropipette bucal estendendo um capilar de vidro fino na chama de um queimador bunsen. Após a extensão da chama, quebre o capilar em dois pedaços se ele não se quebrar em dois pedaços após a extensão.
Se ele quebrou em dois pedaços, corte a ponta da mais longa. Selecione a peça mais longa e teste se o capilar está aberto ao tentar aspirar água. Retire o adaptador de um tubo de silicone de três milímetros.
Conecte o capilar de vidro a um adaptador capilar ligado a um tubo de silicone de seis milímetros. Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de seis milímetros em um filtro de 0,2 micrômetros e um tubo de silicone de três milímetros na outra extremidade. Conecte uma ponta de filtro de um milímetro na extremidade livre do tubo de silicone de três milímetros para aspirar líquido.
Sob um microscópio de dissecção, remova o máximo de líquido possível em torno de uma pelota de vermes fixos com a micropipette bucal. Adicione rapidamente 10 microliters de meio de montagem ao fundo do tubo. Enxágüe uma ponta de 10 microliter em PBS com traços de detergente para evitar que os vermes grudem nas laterais da ponta de pipeta plástica.
Em seguida, corte a ponta da ponta com um par de tesouras. Transfira oito microliters de meio de montagem com os vermes em uma almofada de agarose previamente preparada. Ao observar o slide sob o microscópio, agitar suavemente para evitar a sobreposição dos vermes.
Em seguida, cubra a gota de meio de montagem na almofada de agarose com um deslizamento de cobertura de 18 por 18 milímetros. Para montar vermes vivos, pipeta de três a quatro microliters de três levamisole mililitros dissolvido em M9 em uma almofada de agarose. Escolha de 30 a 50 vermes por condição na gota de levamisole.
Em seguida, cubra a gota com uma cobertura de 18 por 18 milímetros e imagem os vermes dentro de uma hora. Instale o pacote de software de análise de imagem de código aberto Fiji do ImageJ, ou se ele já está instalado no computador, verifique se é a versão 1.52A ou posterior, em seguida, baixe o repositório de linha worm do GitHub e salve-o no computador. Uma vez que todos os componentes do pipeline tenham sido baixados e instalados, abra Fiji e execute a macro de alinhamento worm clicando em plugins, macros e executado na barra de menu principal.
Localize o worm-align. script ijm e clique em abrir. Navegue até a pasta de entrada com as imagens a serem analisadas e clique em selecionar, certificando-se de que a pasta selecionada contém apenas arquivos de imagem.
A macro gerará automaticamente uma pasta de saída onde todos os resultados serão salvos. O nome da pasta será o mesmo da pasta de entrada com saída como pós-correção. Permita que a macro abra a primeira imagem na pasta de entrada e use-a como uma imagem representativa para extrair as configurações necessárias para gerar a montagem, incluindo a largura dos worms, o brilho e o contraste.
Usando a ferramenta de desenho em linha reta, desenhe uma linha através da largura de um worm e clique em OK. Use o comprimento desta linha para determinar a altura das regiões cortadas para vermes únicos. Para cada canal, especifique o nome, a tabela de procura e se ele deve ser incluído na montagem e clique em OK. Em seguida, ajuste as configurações de brilho e contraste para os canais usando os controles deslizantes. Repita este processo para os canais restantes.
Uma vez configuradas todas as configurações, elas serão gravadas em uma tabela de configurações e salvas na subpassa CellProfiler da pasta de saída. Uma imagem é gerada para mostrar como serão todas as imagens após a aplicação das configurações. Se a imagem for satisfatória, marque a caixa superior.
A segunda e terceira caixa do painel de verificação de todas as configurações especificam as opções para a geração de montagem. Deixe ambas as caixas marcadas e clique em OK para executar o resto da macro. A falha na marcação da caixa superior fará com que a macro reprise a configuração.
A macro passa então a abrir todas as imagens na pasta de entrada. Para cada imagem, desenhe linhas no eixo longitudinal de todos os worms a serem incluídos na montagem usando a ferramenta segmentada ou a linha à mão livre. Desenhe as linhas consistentemente da cabeça para a cauda ou vice-versa ao longo do comprimento total dos worms e adicione cada linha ao gerenciador de ROI clicando em Control T.Uma vez que todos os worms desejados tenham sido adicionados, clique em OK. O worm-align gerará, então, imagens cortadas de worms selecionados únicos, que serão salvos na subpasta de um único worm da pasta de saída.
Montagens de todos os worms selecionados serão salvas na pasta alinhada. Baixe e instale o CellProfiler 2.2.0 clicando no link para versões anteriores do CellProfiler na página de download e selecionando o sistema operacional necessário. Antes de iniciar o pipeline Worm_CP, certifique-se de que todas as imagens de saída esperadas estejam presentes na subpasta CellProfiler da pasta de saída de alinhamento worm.
Uma cópia processada da imagem original, uma máscara de imagem binária da população de vermes, alinhar a máscara se a linha for desenhada em worms selecionados e uma imagem representando cada um dos canais na imagem original deve estar presente. Abra o CellProfiler e clique no módulo de entrada de imagens e arraste a pasta do módulo CellProfiler para a janela que diz soltar arquivos e pastas aqui. Se uma lista de imagens estiver presente a partir de uma análise anterior, remova-as primeiro clicando com o botão direito do mouse na janela e selecionando a lista de arquivos claras.
Clique no módulo de entrada de metadados e no segundo método de extração, clique na pasta amarela e navegue até a subpasseira CellProfiler da pasta de saída de alinhamento worm. Selecione o arquivo de configurações e clique em atualizar. Em seguida, clique no módulo de entrada de nomes e tipos e certifique-se de que todas as imagens necessárias para o pipeline estão presentes.
Antes de executar o pipeline, selecione um destino para os resultados de saída no módulo de saída. Use o modo de teste para ver como o pipeline se sai clicando no modo de teste iniciar e permitir que ele execute a primeira imagem na pasta. Quando estiver satisfeito com o desempenho do pipeline, clique no modo de teste de saída e analise imagens.
Antes de iniciar a análise, certifique-se de que todos os olhos na frente do módulo de análise estejam fechados. Quando a análise estiver concluída, abra a pasta de saída Worm_CP que consiste em dois arquivos CSV, worms CSV e linhas CSV. Culturing e imagem C.elegans de acordo com o método descrito neste protocolo produz grandes imagens de visão geral de populações de vermes.
A saída do gasoduto depende em grande parte da qualidade das linhas desenhadas em cima das imagens. Vários exemplos de linha e sua saída de Worm-align são mostrados aqui. Ao usar o script de alinhamento worm, a identificação visual de vermes interseccionais é possível a partir das imagens de sobreposição encontradas na subpastopa de dados, bem como dos painéis de worms individuais na montagem.
A tabela QC também pode ser usada para identificar vermes sobrepostos. No entanto, as linhas de intersecção são problemáticas para o Worm_CP pipeline. Isso porque Worm_CP usa máscara de linha, não regiões de interesse, para ajudar a identificar vermes individuais.
Portanto, o CellProfiler irá segmentar um dos worms como dois objetos. O Worm_CP pipeline tem sido usado para quantificar a intensidade da fluorescência de animais fixos rotulados com um corante fluorescente que incorpora gotículas lipídicas. O teor de gotículas lipídicas é reduzido em 17% entre animais do tipo selvagem e mutantes DBL1 usando quantificação manual, e em 12% usando o Worm_CP pipeline.
Worm_CP também foi usado para quantificar a resposta de choque térmico em vermes vivos expressando GFP sob controle de um gene indutível de choque térmico. Na ausência de estresse térmico, os vermes não induziram a expressão GFP. Quando os vermes são expostos como um choque de calor curto, a expressão GFP é induzida.
A saída de Worm_CP depende em grande parte da qualidade das linhas que você desenha usando worm-align. Certifique-se de que suas linhas não estão tocando ou sobrepostas e desenhe todas as suas linhas na mesma direção. Verificar a tabela QC pode ajudá-lo a identificar linhas que estão tocando ou sobrepondo para que você possa excluir esses casos de sua análise.
A saída do Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente em Fiji ou em outros pacotes de software de análise de imagem. Mostramos aqui um pipeline muito básico do CellProfiler no qual outros módulos de análise poderiam ser facilmente incorporados, por exemplo, para contar o número de gotículas lipídicas ou quantificar a intensidade de gotículas individuais dentro de um worm. Uma das vantagens dessa técnica é a possibilidade de quantificar a fluorescência de vermes individuais rapidamente.
Em nosso laboratório, temos interesse em viabilidade individual usando repórteres de fluorescência e usamos worm-align e Worm_CP rotineiramente para este fim.
