Wir präsentieren zum ersten Mal einen neuen Ansatz für die reproduzierbare und skalierbare Erzeugung von IPS-Zellen, die bei Cerebellar Organoiden abgeleitet wurden, und eine chemisch definierte Bedingungen, die Single-Use-Bioreaktoren verwenden. Um Zellen für die Aussaat des Bioreaktors zu erhalten, fügen Sie einen Milliliter Zellablösungsmedium zu jedem Brunnen einer sechs Brunnenplatte menschlicher iPSC hinzu. Inkubieren Sie die Platte sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sanftes Schütteln die Zellen leicht vom Brunnen löst.
Mit einer P 1000-Mikropipette, pipet das Zellablösungsmedium nach oben und unten, bis sich die Zellen in einzelne Zellen auflösen. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter, von kompletten Zellkultur Medium zu jedem Brunnen, dies wird die enzymatische Verdauung inaktivieren. Dann verwenden Sie die Pipette, um die Zellen vorsichtig in ein steriles konisches Rohr zu übertragen.
Zentrifugieren Sie das Rohr mit 210-facher Schwerkraft für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypan-Blaufarbstoff.
Siehe den Bioreaktorbehälter mit dem iPSC mit einer Dichte von 250 000 Zellen pro Milliliter. Setzen Sie den Bioreaktorbehälter in die Universal Base Unit in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid ein. Um die iPSC-Aggregation zu fördern, legen Sie die Rührrate der Basissteuereinheit auf 27 RPM fest.
Am ersten Tag, wobei Tag Null der Tag der Aussaat des Bioreaktors ist, legen Sie den Bioreaktor und die Basiseinheit in eine sterile Durchflusshaube, verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um eine Ein-Milliliter-Probe der Zellsuspension zu sammeln. Die Zellaufhängung in einem ultraniedrigen Aufsatz, 24 Well-Platte. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich von iPSC abgeleitete Aggregate gebildet haben.
Wenn ja, erfassen Sie Bilder der Aggregate bei 40 X oder 100 X. Fahren Sie fort, die iPSC und den Bioreaktor zu kultivieren, bis der durchschnittliche Durchmesser der Aggregate 100 Mikrometer beträgt, und ersetzen Sie dann 80 % des Mediums durch frisches MT01 ohne Gesteinshemmer. Wenn die Aggregate, erreichen 200 bis 250 Mikrometer im Durchmesser, lassen Sie alle Organoide setzen, an der Unterseite des Bioreaktors, dann ersetzen Sie alle verbrauchten Medium, mit gfCDM Differenzierung szenieren Medium. Legen Sie die Basiseinheit und den Bioreaktor in den Inkubator und verringern Sie die Rührung auf 25 Umdrehungen pro Minute.
Nach dem Entfernen des Überstandes aus den gespeicherten Organoiden, fügen Sie einen Milliliter 15%Saccharose in das Pellet, und mischen Sie gut durch Wirbeln sanft. Nach dem Inkubieren der Organoide über Nacht, bei vier Grad Celsius, entfernen Sie die Saccharoselösung, fügen Sie dann einen Milliliter 15%Saccharose, 7,5% Gelatine hinzu und mischen Sie schnell durch sanftes Wirbeln. Während die Organoide bei 37 Grad Celsius inkubieren, füllen Sie einen Kunststoffbehälter auf halbem Weg mit der 15%Saccharose 7,5%Gelatinelösung, und lassen Sie es verfestigen.
Nachdem die Organoide eine Stunde lang inkubiert haben, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um einen Tropfen der organoiden Saccharose-Gelatine-Mischung auf die erstarrte Saccharose und Gelatine zu legen. Nachdem Sie 15 Minuten gewartet haben, bis sich der Tropfen erstarrt, füllen Sie den Rest des Kunststoffbehälters mit mehr 15%Saccharose, 7,5% Gelatine, lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur erstarren und dann für 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Schneiden Sie die Gelatine in einen Würfel, mit den Organoiden in der Mitte, fixieren Sie den Würfel auf ein Stück Pappe, mit einem Tropfen OCT-Verbindung, dann platziert 250 Milliliter Isopentan, in einem 500 Milliliter Tasse, füllen Sie einen entsprechenden Behälter, mit flüssigem Stickstoff.
Mit Zangen und dicken Handschuhen, legen Sie vorsichtig die Tasse Isopentane, auf der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs. Isopentan und flüssige Stickstoffe sind gefährliche Reagenzien. Die Verwendung dieser beiden Reagenzien erfordert persönliche Schutzausrüstung, einschließlich dicker Handschuhe und eine ausreichende Belüftung.
Wenn das Isopentane auf negative 80 Grad Celsius abgekühlt ist, legen Sie den Gelatinewürfel in das Isopentane, bis er gefriert. Ein gut gefrorener Würfel erzeugt einen metallischen Klang, wenn er leicht mit Zangen angezapft wird, was darauf hinweist, dass er lagerbereit ist. Waschen Sie die Mikroskopschlitten mit den organoiden Abschnitten, mit 50 Milliliter nX PBS für fünf Minuten, dann übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das frische 1X PBS enthält.
Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das 50 Milliliter frisch zubereitetes Glycin enthält und 10 Minuten bei Raumtemperatur brütet, und übertragen Sie die Dias dann in ein Coplin-Glas, das 50 Milliliter 0,1%Triton enthält und 10 Minuten bei Raumtemperatur durchlässig ist. Waschen Sie die Dias zweimal mit 1X PBS, jeweils fünf Minuten lang. Bereiten Sie die Immunostaining Schale, mit drei Millimeter Papier, in 1X PBS getränkt.
Trocknen Sie die Dias mit einem Gewebe um die Scheiben herum und legen Sie sie auf das Drei-Millimeter-Papier. Mit einer Pasteur Pipette, decken Sie jeden Schlitten mit 0,5 Milliliter Blockierlösung. Nach der Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie überschüssige Blocklösung und fahren Sie die Dias mit einem Gewebe, rund um die Scheiben.
Legen Sie 50 Mikroliter verdünnten Primärantikörper auf jeden Schlitten und bedecken Sie sie mit Deckelscheinen. Die Rutschen in der zuvor vorbereiteten Immunostaining-Schale schnüren und bei vier Grad Celsius bebrüten. Nach der nächtlichen Inkubation die Dias in ein Coplin-Glas mit 50 MilliliterN TBST übertragen, die Deckelrutschen abfallen lassen und dann die Dias dreimal mit TBST waschen, jeweils fünf Minuten lang.
Legen Sie 50 Mikroliter, von verdünntem Sekundärantikörper auf jedem Dia, und decken Sie mit den Abdeckungsscheinen ab. Legen Sie die Dias, in die zuvor vorbereitete Immunostaining Schale, inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Die Dias wieder in ein Coplin-Glas geben und dreimal mit 50 Millilitern TBST für jeweils fünf Minuten waschen.
Mit einer Pasteur Pipette, bei 0,5 Milliliter Dappy-Lösung, über die gesamte Oberfläche jedes Schlittens und inkubieren für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach 24 Stunden im Bioreaktor bilden die effizient geformten sphäroidförmigen Aggregate von iPSC. Die Morphologie war bis zum fünften Tag gut gepflegt, mit einer allmählichen Zunahme der Größe.
Nachweis eines hohen Grades an Homogenität. Eine quantitative Analyse mittels Mikroskopie ergab auch eine Normalverteilung der Aggregatgrößen am ersten Tag, und beide Zelllinien erreichten die optimale Aggregatgröße am zweiten Tag. Nachdem der gewünschte Aggregatdurchmesser erreicht wurde, wurde die neuronale Verpflichtung induziert, und dann wurde die Erzeugung verschiedener Kleinhirnvorläufer gefördert.
Während der Differenzierung zeigten Organoide eine ausgeprägtere Epithelisierung ähnlich wie neuralröhrenartige Strukturen mit luminalen Raum. Zusätzlich war die Organoid-Durchmesserverteilung während der anfänglichen Kleinhirn-Verpflichtung bis zum 14. Tag homogen. Die Immunfluoreszenzanalyse unterstützt, dass eine effiziente neuronale Bindung der iPSC-abgeleiteten Organoide bereits erreicht ist, bis zum siebten Tag der Differenzierung.
Immunostaining zeigte auch, effizientes KleinhirnEngagement und effiziente Reifung von Kleinhirn-Organoiden. Darüber hinaus zeigte die lebende abgestorbene Färbung von Organoiden nach 80 Tagen im Bioreaktor eine hohe Zelllebensfähigkeit und keine Hinweise auf nekrotische Bereiche. Diese Technik stellt ein wichtiges Instrument zur Untersuchung pathologischer Wege dar, die an der Degeneration des Kleinhirns beteiligt sind, die bei der therapeutischen Wirkung neuer Medikamente beobachtet wurde, und für die Bewertung der therapeutischen Wirkung neuer Medikamente.
