Unser Protokoll kombinierte mehrere Techniken, die sich für die langfristige Aufrechterhaltung von Organoiden als wirksam erwiesen haben. Dies ist nützlich für die Untersuchung des Alterns bei altersbedingten Krankheiten, bei denen die klinischen Manifestationen außerhalb der Entwicklungsphase liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine spezielle Ausrüstung oder Reagenzien erforderlich sind.
Es basiert stark auf Materialien, die üblicherweise im Labor zu finden sind. Das Altern und neurodegenerative Erkrankungen sind zu einem besonderen Schwerpunkt geworden, da sich unsere aktuellen Modellierungsmethoden hauptsächlich auf etablierte Krankheitsphänotypen und nicht auf die frühen Entwicklungsphasen konzentrieren. Embryonale Stammzellen und iPS-Zellen sind sehr empfindliche Zellen.
Erstanwender sollten sanft sein und Geduld haben. Da es sich um Langzeitkulturen handelt, sollte man sich von Anfang an gedulden. Sprühen Sie zunächst 70%iges Ethanol auf einen Nahtstrang und stellen Sie PLGA-Mikrofilamente her, indem Sie den Nahtstrang mit dem stumpfen Ende des Skalpells ausfransen. Legen Sie die Faser unter ein Mikroskop.
Schneiden Sie die Faser mit einem Lineal in Fragmente von 500 Mikrometern bis zu einem Millimeter langen Strängen. Schneiden Sie insgesamt etwa 25 Millimeter der Faser ab und geben Sie die Filamente in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter Antibiotika-Antimykotika-Lösung enthält. Als nächstes in der Haube die Faserlösung mit 10 Millilitern DMEM/F-12 verdünnen und vortexen, um sie gut zu mischen.
Geben Sie dann 20 Mikroliter der Faserlösung in drei Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Zählen und mitteln Sie mit einem Hellfeldmikroskop die Fasern pro Well. Verdünnen oder konzentrieren Sie die Vertiefungen mit der Faserlösung auf durchschnittlich 5 bis 10 Mikrofilamente pro Vertiefung.
Sobald die zuvor kultivierten induzierten pluripotenten Stammzellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei 10- oder 20-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien weniger als 10 % der Fläche der spontanen Differenzierung aufweisen. Saugen Sie das Medium mit einer Pipette ab und waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS.
Fügen Sie dann 500 Mikroliter Zellablöselösung oder 0,5 millimolare EDTA hinzu, um die Kolonien zu dissoziieren, und inkubieren Sie sie drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter frisches E8-Medium in jede Vertiefung und pipettieren Sie vorsichtig, um alle Zellen zu lösen. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie einen weiteren Milliliter frisches E8-Medium hinzu.
Dann drehen Sie die Zellen bei 290 g für drei Minuten bei Raumtemperatur herunter. Nach der Verwerfung des Überstandes wird das Zellpellet in einem Milliliter des mit 50 mikromolaren ROCK-Inhibitoren angereicherten E6-Mediums resuspendiert und die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt. Präparation einer Zellsuspension mit der gewünschten Sitzdichte in E6-Medien, ergänzt mit dem ROCK-Inhibitor.
Geben Sie dann 150 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer ultraniedrigen 96-Well-Befestigungsplatte. Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte bei 290 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu aggregieren. Dann wird die Platte bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid für die Bildung des Embryoidkörpers inkubiert.
Übertragen Sie die Platte nach 24 Stunden Inkubation in die Haube und saugen Sie vorsichtig 120 Mikroliter des Mediums mit einer Pipette ab, wobei darauf zu achten ist, dass der Embryoidkörper nicht abgesaugt wird, indem die Pipettenspitze zu weit in die Vertiefung abgesenkt wird. Als nächstes werden 150 Mikroliter frisches E6-Medium, ergänzt mit zwei mikromolaren XAV939- und SMAD-Inhibitoren, in jede Vertiefung gegeben. Übertragen Sie die Platte zurück in den Inkubator und ersetzen Sie das Medium täglich durch frisch zubereitetes E6, das mit den Inhibitoren ergänzt wird.
Prüfen Sie am siebten Tag der Inkubation, ob alle Embryoidkörper einen Durchmesser von 550 bis 600 Mikrometern erreicht haben und einen glatten, klaren Rand aufweisen. In diesem Stadium sind sie bereit, in eine extrazelluläre Matrix eingebettet zu werden. Um die Organoide einzubetten, bereiten Sie Noppen-Einbettfolien vor, indem Sie eine vier Zoll lange thermoplastische Deckenfolienfolie auf eine leere P200-Schachtel legen.
Verwenden Sie dann ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen oder ein 500-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen und drücken Sie die Filmfolie vorsichtig in die Löcher, um 12 oder die gewünschte Anzahl von Grübchen zu erhalten. Sprühen Sie anschließend 70%iges Ethanol auf die Folienfolie und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei eingeschaltetem UV-Licht in der Haube trocknen. Tauen Sie währenddessen eine ausreichende Menge der Basalmembranmatrix auf Eis auf.
Übertragen Sie dann mit einer P200-Spitze mit breiter Bohrung einen Embryoidkörper von der 96-Well-Platte auf jedes Grübchen. Entfernen Sie so viel Medium wie möglich mit einer normalen Pipettenspitze, aber lassen Sie den Embryoidkörper nicht trocknen. Als nächstes geben Sie mit einer normalen, vorgekühlten P200-Spitze etwa 30 Mikroliter unverdünnte Membranmatrix zu jedem Organoid und stellen Sie sicher, dass sich der Embryokörper so nah wie möglich an der Mitte des Tröpfchens befindet.
Sobald alle Embryoidkörper in die Matrix eingebettet sind, legen Sie die Filmfolie in eine sterile Petrischale. Anschließend wird die Petrischale bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert, damit sich die Membranmatrix verfestigen kann. Für die Organoid-Differenzierung werden fünf Milliliter des vorbereiteten Differenzierungsmediums mit B-27 ohne Vitamin A in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit extrem niedriger Bindung gegeben.
Die Platte im Inkubator auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Sobald sich die Membranmatrix verfestigt hat, übertragen Sie die eingebetteten Embryoidkörper auf die 6-Well-Platte, indem Sie die Grübchen von der Rückseite der Filmfolie herausdrücken. Verwenden Sie bei Bedarf einen Milliliter Medium aus der Vertiefung und pippen Sie es auf die Folie, um die Tröpfchen von der Folienfolie zu lösen.
Die in die Membranmatrix eingebetteten Embryoidkörper differenzierten sich zu zerebralen Organoiden, die in vitro bis zum Tag deutliche Knospungsformationen zeigten 10. Am Tag in vitro 30 werden die Organoide entweder durch Grübchen- oder Sandwich-Einbettung weiter gereift. Die Langzeitkultur zeigt, dass zerebrale Organoide zu beträchtlicher Größe herangewachsen sind.
Am siebten Tag in vitro zeigen die Embryoidkörper SOX2-positive neuronale Rosetten, verstreute unreife Neuronen und neuronale Vorläuferzellen. Während sie tagsüber in vitro 120 ausgereifte neuronale Marker wie MAP2 und NeuN aufweisen. Diese Zytoskelettmarker können in Verbindung mit anderen postmitotischen Markern wie Doublecortin und Synapsin verwendet werden, um die synaptische Plastizität und andere altersbedingte Abnahmen sowie zusätzliches Hirngewebe wie Astrozyten und Gliazellen zu untersuchen.
Es ist wichtig, dass die Ränder des Gewebes intakt bleiben. Um schädliche Scherkräfte zu minimieren, sollten Rohrleitungen langsam verlegt werden, z. B. beim Wechsel des Mediums und der Organoideinbettung. Das verlangsamte Organoidwachstum ermöglicht es uns, den Krankheitsverlauf in frühen zellulären Manifestationen zu untersuchen.
Die Herstellung von Organoiden ebnet den Weg zur Früherkennung in der Behandlung vieler Krankheiten.
