Diese Methode kann bei der Untersuchung der frühen menschlichen Kleinhirnentwicklung helfen und wie sie bei neuropsychiatrischen Störungen verändert werden kann. Der entscheidende Vorteil dieser Methode besteht darin, entwicklungsfrühe menschliche Kleinhirnzellen in einer 2D-Schichtstruktur zu erzeugen, ohne komplizierte Schritte durchzuführen. Es ist auch kosteneffizient.
Die Herstellung von Zugpipetten kann am Anfang schwierig sein, aber mit Übung und Zeit wird es einfacher, die Pipetten auf eine Weise zu ziehen, mit der man leichter arbeiten kann. Beginnen Sie die experimentelle Vorbereitung, indem Sie eine 22,9 Zentimeter große Pasteur-Pipette etwa zwei Zentimeter unter dem Hals über den Bunsenbrenner ziehen, um zwei Glaspipetten herzustellen. Die dünnere Seite wird etwa vier Zentimeter kürzer sein als die andere.
Biegen Sie die Spitzen der gezogenen Seite auf der Flamme, um ein glattes R zu erzeugen, legen Sie dann die gezogenen Pipetten in Autoklavhülsen und sterilisieren Sie sie in einem Autoklaven. Am Tag Null fügen Sie einen Milliliter Kleinhirndifferenzierungsmedium, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632 und SB-431542, zu jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Ultra-Low-Attachment- oder ULA-Platte hinzu und legen Sie es in den Inkubator, bis die angehobenen Kolonien bereit sind, in die Vertiefungen gegeben zu werden. Reinigen Sie die differenzierten Zellen mit einer gezogenen Glaspipette.
Das Medium absaugen und einen Millimeter iPSC-Passaging-Lösung für jede 35-Millimeter-Schale hinzufügen. Nach drei Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius das Medium aspirieren und zwei Millimeter Kleinhirndifferenzierungsmedium hinzufügen, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632 und SB-431542 Unter 4-facher Vergrößerung eines Durchlicht-Inversmikroskops die Kolonien mit dem gebogenen Rand der gezogenen Glaspipette anheben. Sobald jede Kolonie angehoben ist, übertragen Sie alle Kolonien vorsichtig mit einer 10-Milliliter-serologischen Pipette in eine Vertiefung der ULA-Platte mit sechs Vertiefungen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede iPSC-Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Am zweiten Tag fügen Sie FGF2 zu jeder Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter einzustellen. Am siebten Tag wechseln Sie ein Drittel des Mediums, indem Sie einen Milliliter verbrauchtes Medium absaugen und durch einen Milliliter frisches Kleinhirndifferenzierungsmedium ersetzen.
Inkubieren Sie die embryoiden Körper für sieben Tage. Schwenken Sie am 14. Tag die Platte, um alle embryoiden Körper in der Mitte der Platte zu sammeln. Dann kippen Sie die Platte und saugen Sie das gesamte verbrauchte Medium mit einem 1000-Mikroliter-Pipetter vom Rand ab.
Wenn die mittlere Menge abnimmt, legen Sie die Platte langsam flach und saugen Sie weiter ab, wobei genügend Medium übrig bleibt, um das Herausziehen der embryoiden Körper zu vermeiden. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter frisches Kleinhirndifferenzierungsmedium hinzu, ergänzt mit 10 Mikromolar Y-27632. Anschließend werden die embryoiden Körper mit einer 10-Milliliter-serologischen Pipette in eine mit Poly-L-Ornithin-Laminin beschichtete Schale überführt.
Am Tag 15 saugen Sie das Medium ab und ersetzen Sie es durch ein frisches Kleinhirndifferenzierungsmedium. Am Tag Null wurden iPSC-Kolonien gereinigt und in ein Kleinhirndifferenzierungsmedium mit SB-431542 und Y-27632 gehoben und in extrem niedrige Befestigungsplatten zur Erzeugung embryoider Körper gelegt. Die Zugabe von FGF2 am zweiten Tag und eine Veränderung von 1/3 Medium am siebten Tag führten dazu, dass embryoide Körper am 14. Tag eine Vergrößerung zeigten.
Die Zellen begannen am 15. Tag von den embryoiden Körpern entlang der beschichteten Oberfläche nach außen zu wandern. Der vollständige Wechsel des Mediums zum Kleinhirnreifungsmedium ab dem 21. Tag führte am 35. Tag zu einer Monoschicht von Zellen mit neuronaler Morphologie und Komplexität. Die Genexpressionsanalyse am Tag 35 ergab, dass die Zellen frühe zerebelläre Vorläufermarker wie glutamaterge Vorläufer, ATOH1, GABAerge Vorläuferzellen, PTF1 alpha und die Purkinje-Vorläuferzellmarker KIRREL2 und SKOR2 exprimieren.
Darüber hinaus wurde auch die Expression des rhombischen Lippenmarkers OTX2 und des meist vorderen Neuronen-spezifischen SIX3 beobachtet. Die immunfluoreszierende Markierung der am 35. Tag geernteten Zellen zeigte eine positive Färbung für die Kleinhirnmarker EN2 und PTF1 alpha, den neuronalen Marker Beta Tubulin III und den Proliferationsmarker KI67. Die Kernfärbung mit 4'6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI zeigte Zellkerne.
Für eine erfolgreiche Differenzierung ist es entscheidend, mit gesunden und undifferenzierten iPSC-Kolonien zu beginnen und möglichst frisch rekonstituierte Reagenzien zu verwenden.
