Dieses intrakranielle Injektionsprotokoll ist wichtig, weil es präzise Injektionen, tägliche Überwachung und genaue Tumorvolumenmessung für eine effektivere Untersuchung von Mechanismen der Hirnmetastasierung ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine serielle Überwachung des interkraniellen Tumorwachstums ermöglicht. Demonstriert wird das Verfahren von Jonathan Spehar, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter des Sizemore Laboratory, und Anna Bratasz, einer bildgebenden Forscherin von der Ohio State University Small Animal Imaging Shared Resource.
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, drehen Sie das Stufenschloss am Bohrer, damit ein Bohreradapter und ein steriler Ein-Millimeter-Bohrer in den Bohrer eingesetzt werden können, und ziehen Sie die Bitschlösser manuell fest, um den Bohrer zu verriegeln. Befestigen Sie den Bohrer am stereotaktischen Rahmen und stellen Sie die Digitale Injektor-Förderrate auf 0,4 Mikroliter pro Minute bei einem Ziel von zwei Mikrolitern ein. Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Pedalreflex bestätigt haben, legen Sie die anästhesierte Maus auf den Rahmen und verwenden Sie das stumpfe Ende eines Baumwollspitzenapplikators, um die Zähne im Trog des Mundbalkens zu positionieren.
Drücken Sie die linke Ohrleiste gegen den medialen Canthus des linken Ohrs, um den Schädel zu stabilisieren, und verwenden Sie die Schraube am stereotaktischen Rahmen, um den Schädel an Ort und Stelle zu verriegeln. Dann sichern Sie die andere Seite des Schädels mit der rechten Ohrleiste in der gleichen Weise. Um ein kalvariales Fenster zu machen, reinigen Sie die Kopfhaut mit drei sequenziellen abwechselnden Betadine-Lösung und 70%Ethanol Peelings und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen drei Millimeter Schnitt durch die Haut entlang des zentralen Medianaspekts des Schädels nach der sagittalen Nahtlinie zu machen.
Identifizieren und orientieren Sie den sterilen Bohrer senkrecht zum Bregma, stellen Sie sicher, dass Sie die digitale Vernier-Skala auf Null zurücksetzen und den Bohrer zwei Millimeter seitlich zur sagittalen Naht und einen Millimeter vor der koronalen Naht bewegen. Bewegen Sie die Haut weg von der Bohrmaschine und mit der höchsten Geschwindigkeit und achten Sie auf die Sehenswürdigkeiten, sorgfältig bohren Sie ein Loch, etwa 0,5 Millimeter tief, durch die Calvaria, kühlen Sie die Bohrstelle mit Tropfen von steriler Wäsche bei Bedarf. Sobald das Calvarialfenster gemacht wurde, heben Sie den Bohrer vorsichtig an und entfernen Sie den Bohrer aus dem stereotaktischen Rahmen.
Für die Krebszelleninjektion befestigen Sie die automatische Injektoreinheit am stereotaktischen Gerät und laden Sie die sechs bis acht Mikroliter Zellen, die in DPBS gründlich resuspendiert werden, in eine sterile Hamilton-Spritze. Legen Sie die Spritze auf den Injektor und geben Sie ein kleines Volumen der Lösung auf einen Sterileinweg-Vorhang, um die Injektionsnadel zu grundieren. Verwenden Sie einen Baumwollspitzen-Applikator, um die Spritze mit 70% Ethanol abzuwischen und die Nadelspitze in der Mitte des Kalbsfensters auszurichten, bis sie fast das freigelegte Großhirn berührt.
Setzen Sie die digitale Vernier-Skala auf Null zurück und legen Sie die Nadel langsam in eine Tiefe von drei Millimetern in das Gehirn ein. Lassen Sie die Nadel im Gehirn für mindestens 60 Sekunden, bevor Sie auf dem Injektor-Bildschirm ausführen, um die Zellabgabe an die Injektionsstelle zu beginnen. Wenn alle Zellen geliefert wurden, lassen Sie die Nadel für mindestens drei Minuten im Gehirn ruhen, damit das Gehirn Parenchym an die Injektion akklimatisieren kann, bevor die Nadel aus dem Gehirn mit einer Rate von 0,75 Millimeterpro Minute zurückgezogen wird.
Für die Magnetresonanztomographie der Tumorbelastung, 10 bis 20 Minuten vor der Bildgebung zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt, verabreichen Sie 100 Mikroliter pro 20 Gramm Körpergewicht Gadolinium-basierte Kontrastmittel zur Maus durch Standard-intraperitoneale Injektion. Betäuende die Maus nach der Injektion und legen Sie die anästhesierte Maus auf einen beheizten Halter. Platzieren Sie den Halter in einen 9,4-T-Magneten, der mit einer Maus-Gehirn-Oberflächenspule ausgestattet ist, und erhalten Sie ein Lokalisiererbild.
Dann bilde das Maushirn mit einer T2 gewichteten seltenen Sequenz und post gadolinium-basierten Kontrast T1 gewichtet seltene Sequenz. Um das gesamte Tumorvolumen zu messen, öffnen Sie die MRT-Datendatei, die für ImageJ von Interesse ist, und verwenden Sie das Werkzeug zur freien Auswahl, um einen Umriss um den Tumor zu zeichnen. Öffnen Sie dann die Registerkarte Analysieren, und wählen Sie Maß aus, um den Bereich der ausgewählten Region abzusuchen.
Wenn alle Tumorenthaltenden Scheiben für eine einzelne Maus zu diesem bestimmten Zeitpunkt bewertet wurden, exportieren Sie die Werte in ein entsprechendes Datenanalyseprogramm. Hier kann eine repräsentative Übersicht über die Tumorvolumenquantifizierung für eine einzelne Maus an Tag 7 und Tag 10 nach der murinen Brusttumorzellinjektion beobachtet werden. Die Auswertung von 30 Scheiben pro Scan ergab, dass für diese Analyse an Tag sieben nach der Injektion fünf Scheiben eine Tumorbelastung aufwiesen.
Während am Tag 10, neun Scheiben zeigten eine Tumorbelastung. Der Tumorbereich in jedem Bild wurde dann wie gezeigt gemessen, so dass die Veränderung des Tumorvolumens im Laufe der Zeit verfolgt werden konnte. Jede Zelllinie und jedes Empfängermausmodell ist eindeutig und erfordert daher eine Optimierung der Anzahl der injizierten Zellen und des MRT-Zeitplans, um die Bildgenauigkeit zu gewährleisten.
Nach diesem Verfahren kann das Gehirn für im Wesentlichen alle nachgeschalteten Assays geerntet werden, einschließlich einzelliger Isolation oder histopathologischer Analyse.
