Wir haben die Schwanzvenenmethode verwendet, um Hirnmetastasen in Mausmodellen zu erzeugen, indem wir Zelllinien von Patientinnen mit entzündlichem Brustkrebs (IBC), einer hochaggressiven Form von primärem Brustkrebs, verwendet haben. Die Erzeugung von Hirnmetastasen in Mausmodellen erfolgt typischerweise durch intrakardiale oder intracarotis-arterielle Injektionen. Die Schwanzvenenmethode bietet jedoch einen Vorteil gegenüber diesen Techniken, da sie die Schritte der Besiedlung von Hirnmetastasen besser nachahmt und relativ einfach durchzuführen ist.
Die Ärzte Xiaoding Hu und Emilly Villodre, die beide Ausbilder in meinem Labor sind, werden das Verfahren demonstrieren. Um Hirnmetastasen mittels GFP-Bildgebung acht bis 10 Wochen nach der Tumorzellinjektion nachzuweisen, desinfizieren Sie die Maus mit 70%igem Ethanol und entfernen Sie das Fell von Kopf und Ohren. Schneiden Sie den zervikalen Bereich des Halses ab.
Schneiden Sie den Schädel heraus und entfernen Sie ihn, damit das Gehirn entnommen werden kann. Legen Sie das Gehirn in eine Gewebekassette und legen Sie die Kassette für nicht länger als eine Stunde in einen Behälter mit kaltem DPBS. Für die stereomikroskopische Bildgebung wird das Gehirn in einen 100 Zentimeter langen Gewebeschalendeckel unter ein mit UV-Licht ausgestattetes Stereomikroskop übertragen und das 0,5-fache Objektiv gewählt, um die Visualisierung des gesamten Gehirns zu ermöglichen.
Drücken Sie die Live-Ansicht und fokussieren Sie die Ansicht, während sich das Gehirn in der ventralen Position befindet. Wählen Sie in der Software und im Mikroskop den entsprechenden Filter für den fluoreszierenden Marker in den Zellen aus und machen Sie ein Bild. Wechseln Sie, ohne die Probe zu verschieben, zur Hellfeld-Bildgebung und wählen Sie den Hellfeldfilter aus.
Machen Sie ein Foto. Stellen Sie sich dann das Gehirn in der dorsalen Position vor, wie zuvor gezeigt. Um die Bilder des gesamten Gehirns zu analysieren, konvertieren Sie zunächst die Bilddateien von TIFF in JPEG, damit sie mit jedem Computer geöffnet werden können, der nicht über die zugehörige Software verfügt.
Öffnen Sie als Nächstes ein Paar Hellfeld- und Fluoreszenzbilder und wählen Sie Datei- und Zusammenführungskanäle aus. Wählen Sie die richtigen Komponenten aus, klicken Sie auf OK und speichern Sie das zusammengeführte Bild. Um den Hirntumorbereich im Fluoreszenzbild zu quantifizieren, wählen Sie die automatische Auswahl.
Verschieben Sie den Pfeil in den GFP-Positionsbereich und klicken Sie, um automatisch eine Auswahl zu erstellen. Klicken Sie dann erneut, um die Auswahl zu bestätigen. Alle Maße werden angezeigt.
Wenn mehr als ein GFP-positiver Bereich beobachtet werden kann, wiederholen Sie die Messung mit dem nachfolgenden Bereich. Hirnmetastasen können bereits acht Wochen nach der Injektion mittels Luciferase-Bildgebung und Stereofluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Nach der Bildgebung können Teile der Hirnmetastasen formalinfixiert und für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung aufbereitet werden, um das Vorhandensein von Hirnmetastasenläsionen zu validieren, und für die immunhistochemische Färbung, um spezifische Proteinmarker von Interesse nachzuweisen.
Bei der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten, indem die Zellen nicht länger als eine Stunde auf Eis gelegt werden, und Luftblasen in der Zellsuspension zu vermeiden, um die Bildung von Embolien und die Sterblichkeit von Mäusen zu verhindern. Nach der Injektion der Schwanzvene überwachen wir das Wachstum und die Progression der Hirnmetastasen mit Luciferase-Bildgebung. Nach der Euthanasie bestätigten Stereofluoreszenzmikroskopie und Histologie Metastasenläsionen.
