Dieses Protokoll ermöglicht es, den Grad und die Dynamik der Arginin-Methylierung zu quantifizieren. Diese Modifikation spielt eine wichtige regulatorische Rolle und könnte als Biomarker für Krankheiten dienen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie einen einfachen Arbeitsablauf für eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Matrices bietet, die von Zellen, Medien bis hin zu Geweben und Bioflüssigkeiten reichen.
Die Arginin-Methylierung ist bei vielen menschlichen Krebsarten erhöht, und die ersten Inhibitoren von Arginin-Methodentransferasen werden in klinischen Studien getestet. Diese Methode könnte bei der Stratifizierung von Patienten und der Risikobewertung helfen. Hansjörg Habisch, ein Forschungstechniker aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.
Bei flüssigen Proben 400 Mikroliter eiskaltes Methanol zu 200 Mikrolitern der Probe geben, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie diese Probe bei 10.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Bewegen Sie den Überstand und sammeln Sie das Pellet in 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Für feste Materialien geben Sie 600 Mikroliter 66% Methanolwasser in Zellstoffröhrchen mit 30 bis 60 Milligramm Gewebe oder Zellpellets. Homogenisieren Sie das Weichgewebe einmal für 20 Sekunden und das steife Gewebe zweimal für 20 Sekunden mit einem Intervall von fünf Minuten dazwischen. Legen Sie die Probe sofort auf Eis und überführen Sie das gesamte Lysat in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von der Inkubation.
Anschließend wird die Probe 30 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Bei vier Grad Celsius wählen Sie den Überstand in 1,5-Milliliter-Röhrchen und fahren mit der Proteinhydrolyse mit diesem Überstand fort. Schneiden Sie die Kappen jeder Röhre ab.
Dann fügen Sie jeder Probe 500 Mikroliter neun molare Salzsäure hinzu. Zum Schluss legen Sie die Röhrchen in Glasröhrchen. Verschließen Sie sie mit Kappen fest, um eine ordnungsgemäße Abdichtung zu gewährleisten, und legen Sie diese Röhrchen in ein Glasbecherglas, das teilweise mit Sand gefüllt ist.
Hydrolysieren Sie die Proben für 16 Stunden bei 110 Grad Celsius in einer Trockenkammer. Kühlen Sie die Proben ab und lyophilisieren Sie sie über Nacht mit einer Hochvakuumzentrifuge. Am nächsten Tag vollständig getrocknete Pellets in einem Milliliter 0,1 molare Salzsäure auflösen.
Geben Sie 50 Mikroliter Chloroform in jedes Röhrchen und lösen Sie das Pellet mit einer 1.000 Mikroliter Pipette gründlich auf. Füllen Sie das gesamte Volumen in ein neues Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten. Sammeln Sie vorsichtig die obere Phase der zweiphasigen Flüssigkeit in einem neuen Röhrchen.
Verwenden Sie Kunststoffrohre für manuelle oder Glasröhren für die robotergestützte Festphasenextraktion. Für die manuelle Festphasenextraktion müssen die Kartuschen bei jedem Durchlauf vorkonditioniert werden, gefolgt von einer einminütigen Zentrifugation. Danach wird die Probe auf SPE-Kartuschen geladen und bei 600 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Waschen Sie die Kartuschen dreimal mit einem Milliliter Wasser, gefolgt von einer Zentrifugation für eine Minute. Anschließend fünfmal mit einem Milliliter 0,1 molar Salzsäure waschen, anschließend eine Minute bei 800 g Raumtemperatur zentrifugieren. Waschen Sie die Kartuschen zweimal mit einem Milliliter Methanol, gefolgt von einer Zentrifugation für eine Minute.
Eluieren Sie Arginin und seine Derivate in ein einzelnes 15-Milliliter-Röhrchen durch Zugabe eines Milliliters von drei X-Ersatzlösungen und zentrifugieren Sie zweimal für eine Minute. Für die robotergestützte Festphasenextraktion legen Sie die Röhrchen zum Sammeln von Eluaten und die Glasröhrchen, die die obere Phase der biphasischen Flüssigkeit enthalten, in die entsprechende Position des Roboters. Verwenden Sie eine Anwendung oder Methode in der Software, die auf den Schritten basiert, die für die manuelle SPE beschrieben sind.
Gefrieren Sie die Proben über Nacht, um sie vollständig zu trocknen, um Ammoniak und Wasser loszuwerden. Lösen Sie jede Probe in 500 Mikroliter NMR-Puffer auf, bis sie homogen wird. Übertragen Sie dann eine gleiche Menge homogener Probe in jedes NMR-Röhrchen.
J-RES-Spektren von Hefeproteinhydrolysaten, die mit dem SPE-Protokoll gereinigt wurden, sind hier dargestellt. Verschiedene charakteristische chemische Verschiebungen können L-Arginin und ADMA bei 3,25 und 3,02 ppm unterscheiden. Beide Substanzen können in einer zellulären Matrix getrennt und quantifiziert werden.
Basierend auf der Anzahl der Protonen der spezifischen Methyl- oder Methylengruppe bei der jeweiligen chemischen Verschiebung ermöglicht eine H-Kernspinresonanzspektroskopie eine präzise Quantifizierung. Mit diesem Ansatz können die chemischen Verschiebungen von SDMA und MMA durch charakteristische chemische Verschiebungen bei 2,76 Teilen pro Million SDMA und 2,74 Teilen pro Million MMA getrennt und quantifiziert werden. Sammeln Sie bei der Durchführung dieses Protokolls vorsichtig die obere Phase der zweiphasigen Flüssigkeit, die die wasserlösliche Fraktion enthält, mit einer Pipette und übertragen Sie sie in neue Röhrchen.
Verwenden Sie 1,5-Milliliter-Röhrchen für manuelle SPE oder Klassenglas für Roboter-SPE. Vermeiden Sie das Verschütten von Chloroform und seinem Inhalt. Die argininhaltigen Eluate und die methylierten Arginin-Spezies werden mittels NMR-Spektroskopie analysiert.
Daraus ergeben sich absolute Mengen dieser Arten. Unsere Technologie wird derzeit in einer Vielzahl von Grundlagenforschungsprojekten eingesetzt, die darauf abzielen, die pathophysiologische Rolle der Arginin-Methylierung zu analysieren. Darüber hinaus evaluieren wir die Protein-Arginin-Methylierung als Biomarker-Kandidat bei verschiedenen menschlichen Erkrankungen.
