Diese Arbeit wurde durch ein Ehrman Stipendium für HY unterstützt. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research Postdoc-Stipendium, um RJJ, NIH Grant F32EY016309 auf DV, ein New York University Deans Dissertation Fellowship DJ, NIH GrantR01 EY13010 auf CD und ein DFG-Stipendium für JR (RI 2208/1- 1). Wir danken Nina Vogt und Pamela Boodram für Kommentare zum Manuskript.

Ein. Einführung In diesem Video beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Entwicklungszeiten: die dritte Larvenstadium Larvenstadium, das midpupal und die erwachsenen Stadium. Obwohl unser Protokoll auch für andere Puppen Stufen (für Details auf die früheren Stadien, siehe 16), wählten wir die midpupal Bühne, wie es optimal für die Bildgebung ist alles PRs in einer Brennebene und ihre Kerne sind leicht zu identifizieren, die erleichtert die Visualisierung von Transkriptionsfaktor Expressionsmuster. Die Dissektion der späten Puppenstadium Netzhaut ist sehr ähnlich zu der Präparation der erwachsenen Netzhaut. Zuerst zeigen wir, wie man Larven und Puppen an den gewünschten Stufen zu sammeln. Dann erklären wir, wie die optimale Dissektionen der Larven 17-18, midpupal und erwachsenen Netzhaut erhalten. Zweitens zeigen wir, wie man PR Entwicklung in diesen Stadien mittels Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie visualisieren. Die Entwicklungszeit von Insekten ist temperaturabhängig. Um reproduzierbare Inszenierung von Larven und Puppen zu erleichtern, empfehlen wir erhöhen alle fly Aktien bei 25 ° C unter einem 12 hr/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Third-Larven: Über 96 Stunden nach der Eiablage (bei ​​25 ° C), späten dritten Larvenstadium Stop Fütterung und wandern an den Wänden der Lebensmittel Fläschchen, wo sie schließlich verpuppen. Verwenden Sie einen weichen Pinsel oder einer Pinzette vorsichtig entfernen wandernden dritten Larvenstadium Larve aus der Wand des Lebensmittel Fläschchen. 50% Puppen (&#39;midpupae&#39;) sind etwa 48 Stunden nach der Verpuppung beobachtet. Für exaktes Timing, können Sie einfach geformten weißen Puppen mit einem Marker auf die Lebensmittel Flasche kreisen. Alternativ dazu können Sie alle weißen Puppen zu einem neuen Fläschchen ein Fläschchen einheitlichen Inszenierung (für die Inszenierung der Puppen anhand morphologischer Kriterien, siehe 19) zu erhalten. Nach 48 Stunden, sorgfältig remove der midpupae aus dem Fläschchen mit einer Pinzette. Erwachsenen Fliegen: Anesthetize jungen erwachsenen Fliegen (2-5 Tage nach Schlüpfen) auf einem CO 2-Pad. Entfernen Kopf mit einer Pinzette und speichern sie in einem Glas gut austeilen mit kaltem 1x PBS. 3. Dissection Procedure (ca. 1-2 h pro Experiment) Nach dem Sammeln der Probe, legen Sie sie in einem Tropfen kaltem PBS auf einem Sylgard Dissektion Gericht. Dissect etwa 10-15 Netzhaut pro Genotyp. Bitte beachten Sie die Material Safety Data Sheets sowie Ihre Institution Environmental Health and Safety Office für die richtige Handhabung der Reagenzien und Geräte (siehe Tabellen am Ende dieses Protokolls). Ein. Larven Eye Imaginalscheiben <ol><li> Suchen Sie das vordere Ende der Larve, die die Mundhaken enthält. Verwenden Sie eine Zange, um den mittleren Teil der Larve drücken Sie vorsichtig gegen die Basis des Sylgard Gericht. Verwenden Another Zange, um die Mundhaken packen und ziehen Sie vorsichtig und langsam vom Körper weg. Entsorgen Sie die wichtigsten Teil des Körpers und nutzen Sie die Mundwerkzeuge, um den vorderen Teil halten, um fremde Gewebe aus den Imaginalscheiben die beigefügte an das Gehirn bleibt entfernen. </li><li> Übertragen Gehirn mit Imaginalscheiben durch Greifen die Mundhaken mit einer Pinzette auf 1x PBS in einem Drei-well Glasschale. Führen Fixierung (Schritt 4.1.). </li><li> Nach der Fixierung, entfernen Speicheldrüsen, Fettgewebe und ziehen das Gehirn vom Auge weg-antennalen Imaginalscheibe. Um die Zugänglichkeit zu der &quot;schwierig&quot; Antikörper zu verbessern, kann die peripodial Membran, die auf der Oberfläche des Epithels liegt, durch Halten der antennalen Teil der Scheibe und Ablösung der Membran weg mit einem Präpariermikroskop Stift entfernt werden. Als nächstes führen Immunhistochemie (Schritt 5.1.). </li></ol> 2. 50% Verpuppung / Midpupal Netzhäute <ol><li> Halten hinteren Ende des Kokons mit einer Pinzette.Entfernen Sie vorsichtig die vordere Oberfläche des Kokons durch Greifen die Nagelhaut mit einem anderen Pinzette und ziehen weg von der Puparium. Peel entfernt restliche Schuppenschicht, um den Kopf freizulegen. </li><li> Verwenden Sie die Zange &quot;Tipps zum Durchstoßen der zugrunde liegenden, weichen Sack in der dorsalen Frontzahnbereich. Dies ermöglicht den Zugang zum Kopf. Vorsichtig trennen den Kopf aus dem Thorax durch langsames Ansaugen der Kopf mit einem P20 Pipette. Vertreibt Kopf Pipettenspitze in frischem, kaltem 1x PBS und entfernen überschüssiges Gewebe, kaufen Sie den Kopf Nagelhaut und entfernen Rüssel. Gehen Sie zur Fixierung (Schritt 4.1.). </li><li> Pierce die Optik lobe mit einem Sezieren pin zu stabilisieren das Gewebe. Stecken Sie das andere Sezieren Stift zwischen der Lamina und der Retina, um die Netzhaut von der Lamina / optic Lappens trennen. Führen Immunhistochemie (Schritt 5.1.). </li></ol> 3. Adult Augen <ol><li> Besorgen Sie sich die Mitte des hinteren Kopfkapsel mit einer Zange und entfernen Mundwerkzeuge (Rüssel), Fett tissue und Tracheen. </li><li> Besorgen Sie sich die dorsale Kopf Nagelhaut mit einer Zange und mit der anderen die Augen aus Hirngewebe durch leichtes Ziehen seitwärts zu trennen. In den meisten Fällen wird die Lamelle eine dünne und transparente Hülle aus Gehirn Neuropil, zur Retina befestigt bleiben. Es ist einfacher, die Lamina nach Fixierung entfernen. </li><li> Entfernen Cuticula am Auge Rand, sondern lassen ein kleines Stück zurück, um die Übertragung der Netzhaut, verschiedene Lösungen zu erleichtern. Führen Fixierung (Schritt 4.1.). </li><li> Entfernen der Lamina durch Greifen es an einer Seite mit einer Pinzette vorsichtig und seitlich mit der anderen Zange ohne Beeinträchtigung der Netzhaut. Rückstände von Nagelhaut, wie es auf die Netzhaut während der Montage klappen könnte. Diese beiden Schritte sind kritisch für die Visualisierung Photorezeptoren, die andernfalls durch die Lamina verdeckt werden würde und bleibt der Kutikula während des bildgebenden Verfahrens. Gehen Sie zur Immunhistochemie (Schritt 5.1.). </li></ol> 4. Fixierung und Washing (ca. 1 Std.) <ol><li> Bewahren Sie die seziert Netzhaut in 1x PBS in einem Drei-well Glasschale auf Eis gelegt, während frisch bereitet das Fixiermittel (Verdünnung 40 Mikroliter 37% Formaldehyd-Lösung mit 360 ul 1x PBS, vortexen und auf Eis). Wir empfehlen, mit der Fixierung Protokoll vorzugehen und lange Lagerzeiten auf Eis (&gt; 15 min) zu vermeiden. </li><li> Ersetzen 1x PBS mit 200 ul 3,7% Formaldehyd-Lösung. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe in Fixierlösung eingetaucht ist. Dies ist kritisch, da es sonst nicht richtig befestigt werden. Falls notwendig, entfernen Luftblasen und Tracheen mit der Pinzette. </li><li> Inkubieren am Schüttler für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Fixiermittel mit 1x PBS und spülen zweimal mit 1x PBS. Weiterhin Waschen in PBS 30 min (auf Schüttelmaschinen, bei Raumtemperatur). </li><li> Ersetzen PBS mit PBST. Spülen zweimal mit PBST. </li><li> Fahren Sie mit dem Entfernen der peripodial Membran von Larven Auge Discs (3.1.3.) Und die Lamellen aus midpupal / Erwachsene Netzhaut &lt;strong&gt; (3.2.3., 3.3.4.). </li></ol> 5. Immunhistochemie <ol><li> Sperrung: Ersetzen PBS mit 200 ul 5% normalem Serum in PBST und inkubieren Netzhaut für 20 min auf Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Blockierungslösung mit primärer Antikörperlösung. Verschließen Sie die Drei-Well-Platte mit Parafilm und über Nacht auf Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Lösung mit PBST und spülen 3 mal. Weiterhin Waschen mit PBST für mindestens 1 Stunde am Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Transfer in sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation in einem Parafilm verschlossenen Glas gut Schale auf Schüttler über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Antikörper-Lösung mit PBST und spülen dreimal. Weiterhin Waschen mit PBST für mindestens ein hr am Schüttler bei Raumtemperatur. Die Proben können in PBST für mehrere Tage aufbewahrt werden, aber es ist wichtig, an die frische PBST mindestens einmal pro Tag hinzu, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li></ol> 6. Montage <ol><li> Für die Montage Larven und midpupal Netzhaut, mit der P20 Netzhaut in die Mitte eines sauberen Glasobjektträger übertragen. Entfernen Sie überschüssiges PBST. Verwenden Sie eine Pinzette Netzhaut auszurichten, um Bildgebung erleichtern. </li><li> Fügen Sie 10 ul Eindeckmedium auf der Netzhaut. Cover sie vorsichtig mit einem 24x40-1 Deckglas und Dichtung mit klarem Nagellack. </li><li> Für die Montage erwachsenen Netzhaut, bereiten &quot;Brücken&quot; 20: In zwei 5 ul Tröpfchen von 50% Glycerin an beiden Enden eines Glases Seite und decken Sie sie mit 22x22-1 Deckgläser (0,13 bis 0,17 mm dick). </li><li> Entfernen Sie die PBST mit einem P20-Pipette, stellen Sie sicher, dass die Netzhaut nicht austrocknen. Fügen Sie 20 ul Eindeckmedium zum Brunnen. Verwenden Eindeckmedium auf Netzhaut mit dem P20 der &quot;Brücke&quot; Glasträger übertragen. </li><li> Verwenden Sie eine Zange zu orientieren (Linsen sollte das Glas Gleitfläche) und richten Netzhaut, um Bildgebung erleichtern. Falls notwendig, entfernen Luftblasen mit dem P20. </li><li> LangsamOrt 24x40-1 Deckglas (0,13 bis 0,17 mm dick) von einer Seite auf die Kanten und dichten mit klarem Nagellack oder Klebeband. Proben bei 4 ° C in einem Objektträger saver box (halten im Dunkeln). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Als ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls, zeigen wir repräsentative Ergebnisse zur Visualisierung Photorezeptor Differenzierung bei den drei Entwicklungsstadien in dem Video. Ein larvalen Auge antennalen Scheibe und eine midpupal Netzhaut wurden mit Antikörpern, die verschiedene Typen beschriften Photorezeptor während der Entwicklung (1A, B) und ein Erwachsener Netzhaut wurde mit zwei Rhodopsin-Antikörper angefärbt, um zwei Subtypen Photorezeptor (1C) visualisieren angefärbt.

<ol>
	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+fly+retina.">Functional organization of the fly retina.</a> Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).</li><li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin.">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster.">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells.">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila:+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification.">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li><li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila:+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells.">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc.">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li><li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye.">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development:+sevenless,+bride+of+sevenless+and+rough.">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li><li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila.">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li><li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+fly+eye:+terminal+differentiation+events+of+the+retina,+corneal+lens,+and+pigmented+epithelia.">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Wolff, T., Sullivan, W. e. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Techniques+for+the+Drosophila+Eye+Part+I:+Larva+and+Pupa.">Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development.">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li><li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype.">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina.">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).</li><li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye.">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li><li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin/NF2,+Kibra,+Lgl,+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate.">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li><li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors.">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Ein. Fehlerbehebung Nach unserer Erfahrung erfordern Dissektionen Praxis (bis zu mehreren Wochen) und werden durch das Erreichen eine bequeme Handhaltung 21 durch ruhen die Ellenbogen und Unterarme auf den Tisch und mit den Fingern in Kontakt mit der Dissektion Gericht erleichtert. Auf diese Weise wird nur der Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger durchführen subtilen Bewegungen. Entfernen der Lamina ohne Beschädigung der Photorezeptoren ist wahrscheinli...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS1x, pH 7,4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Bereiten 10x Stammlösung 20. Verdünnen mit destilliertem Wasser auf 1x PBS und bei Raumtemperatur lagern zu erhalten. Kühlen auf Eis, bevor Dissektionen. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Achtung: Reizend Handschuhe tragen. Planen 50 ml 1xPBS mit 0,3% Triton X-100 (PBST). Lagerung bei Raumtemperatur. </td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd-Lösung </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Achtung: Giftig, wahrscheinlich krebserzeugend für den Menschen Handschuhe tragen. Vor der Fixierung, frisch zubereiten 3,7% ige Lösung in einer chemischen Abzugshaube durch Verdünnen mit PBS, auf Eis lagern. </td></tr><tr><td> 5% normalem Pferdeserum </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Planen 5% v / v verdünnt in PBST. Bewahren Sie bei vier Grad. </td></tr><tr><td> Primäre und sekundäre Antikörper (zB Esel anti-Schaf Alexa Fluor 488, Esel-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 555, Esel anti-Maus Alexa Fluor 647) </td><td> Invitrogen Molecular Probes </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Verdünnen Sekundärantikörper 1:800 in PBST und lagern bei vier Grad. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> Verdünnen 1:100 in sekundären Antikörper-Lösung. </td></tr><tr><td> Slowfade Gold-Antifade Reagenz </td><td> Invitrogen Molecular Probes </td><td> S36936 </td><td> Eindeckmedium. Lagerung bei -20 Grad. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Für die Montage. Bereiten 10 ml 50% iger Verdünnung mit destilliertem Wasser, Lagerung bei Raumtemperatur. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Für Betäubung erwachsenen Fliegen. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Zwei scharfe Pinzette (Dumont # 55) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer Kit </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Planen Sylgard Dissektion Schale durch Füllen einer Kunststoff-Petrischale mit Sylgard Mischung. </td></tr><tr><td> Drei-well Glas Dissektion Gerichten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two minutien Sezieren Stifte (0,1 mm Durchmesser) und zwei pinholders (12 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Legen ein minutien Stiftes in jeder der beiden pinholders und beugen einer der Stifte, um einen Haken zu bilden. </td></tr><tr><td> Microscope Deckgläschen (22x22-1 und 24x40-1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger (25x75x1.0 mm; vorgereinigt) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Reaktionsgefäße </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Klaren Nagellack oder Klebeband </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kreisschüttler </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diahalter box </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Dünnen Pinsel </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 und P200 Mikropipetten und Tipps </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kleine Eimer mit Eis </td><td></td><td></td><td> Zur Kühlung der Glas-Well-Platten, seziert Netzhaut und Lösungen. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

Das Facettenauge von Drosophila melanogaster besteht aus etwa 750 Ommatidien (Einheit Augen). Jeder Ommatidium wird von etwa 20 Zellen, einschließlich Objektiv-sezernierenden Zapfenzellen, Pigmentzellen, einer Borste Zelle und acht Photorezeptoren (PRs) R1-R8 2 zusammen. Die PRs spezialisiert haben microvillar Strukturen, die Rhabdomeren, die lichtempfindliche Pigmente, die Rhodopsine (RHS) enthalten. Die Rhabdomere sechs PRs (R1-R6) ein Trapez bilden und enthalten Rh1 3 4. Die Rhabdomere von R7 und R8 im Tandem in die Mitte des Trapezes positioniert und den gleichen Weg des Lichtes. R7 und R8 PRs stochastisch exprimieren verschiedene Kombinationen von Rhs in zwei Subtypen 5: Im &#39;p&#39; Subtyp, Rh3 in p R7s mit RH5 in p R8S gekoppelt ist, während in der &#39;y&#39; Subtyp, Rh4 in y R7s zugeordnet ist Rh6 in y R8S 6 7 8. Frühe Angabe PRs und Entwicklung Ommatidien beginnt in der larvalen Auge antennalen Imaginalscheibe eine Monoschicht von Epithelzellen. Eine Welle der Differenzierung fegt über die Scheibe 9 und initiiert den Aufbau von undifferenzierten Zellen in Ommatidien 10-11. Die Gründer Zelle R8 wird in erster angegebenen rekrutiert R1-6 und dann R7 12-14. Anschließend, während Puppenentwicklung führt PR Differenzierung umfangreiche morphologische Veränderungen 15, einschließlich rhabdomere Bildung, Synaptogenese und schließlich rh Ausdruck. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Zeiträume der Netzhaut Entwicklung, die Anwendung auf eine Vielzahl von Fragen Netzhaut Bildung und Entwicklungswege angesprochen werden können. Hier verwenden wir diese Methoden, um die schrittweise PR Differenzierung am Ebene einzelner Zellen in whole mount Larven, midpupal und erwachsenen Netzhaut visualisieren ( <sTrong&gt; Abbildung 1).

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhaut ist eine kristallartige Gitter aus einer kleinen Anzahl von Zelltypen, die in einer stereotypen Art und Weise erzeugt werden zusammengesetzt<sup&gt; 1</sup&gt;. Seine Eignung für anspruchsvolle genetische Analyse ermöglicht die Untersuchung von komplexen Entwicklungs-Programme. Dieses Protokoll beschreibt Dissektionen und Immunhistochemie von Netzhaut an drei diskrete Entwicklungsstufen, mit einem Fokus auf Photorezeptor Differenzierung.

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

25.1K Aufrufe.  New York University. Die Drosophila Netzhaut ist eine kristallartige Gitter aus einer kleinen Anzahl von Zelltypen, die in einer stereotypen Art und Weise erzeugt werden zusammengesetzt 1. Seine Eignung für anspruchsvolle genetische Analyse ermöglicht die Untersuchung von komplexen Entwicklungs-Programme. Dieses Protokoll beschreibt Dissektionen und Immunhistochemie von Netzhaut an drei diskrete Entwicklungsstufen, mit einem Fokus auf Photorezeptor Differenzi...

Serie: Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Forschung

Neurowissenschaften

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Verhalten der Erwachsenen aus einer seitlichen Perspektive

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...