Diese Forschung wurde durch die "Etablierung von Messstandards für Chemie und Strahlung", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0003, und "Entwicklung von Messstandards und -technologien für Biomaterialien und medizinische Konvergenz", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0004 Programme, finanziert vom Korea Research Institute of Standards and Science, unterstützt. Diese Forschung wurde auch vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT), der National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dem Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt (MOHW), dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dem Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) und dem Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350) unterstützt. ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Wir danken Chang Woo Park für die Unterstützung bei experimenten.

1. Bakterielle Zellkulturen und Herstellung von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS)
HINWEIS: Die Schritte 1.2 – 1.9 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie eine MRS-Agarplatte und eine Brühe mit L-Cystein vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.</li>
	<li>Die MRS-Agarplatte wird in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C mit 20 ppm Sauerstoff vorinkubiert.</li>
	<li>Lactobacillus-Bakterienbestand auftauen und die Agarplatte mit der Bakterienkultur impfen (Abbildung 1A (i)).</li>
	<li>Inkubieren Sie Bakterien für 2 - 3 Tage in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff, bis einzelne Bakterienkolonien erhalten sind.</li>
	<li>Waschen und trocknen Sie das anerobe Kulturröhrchen vom Typ Hungate. Autoklaven Sie das Kulturröhrchen bei 121 °C für 15 min.</li>
	<li>Anschließend wird das Röhrchen in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff inkubiert, um Sauerstoff zu entfernen.</li>
	<li>2 - 3 ml MRS-Brühe in die Tube geben. Verschließen Sie das Rohr mit einem Butylgummi-Stopfen und schrauben Sie den Verschluss.</li>
	<li>Erhalten Sie eine einzelne Kolonie mit einer Schleife und legen Sie sie in die 1,5 ml Kulturröhre mit 500 μL 1x PBS. (Abbildung 1A (ii)).</li>
	<li>Suspendieren Sie die Kolonie mit einer 1-ml-Spritze (Abbildung 1A (iii)). Führen Sie dazu die Nadel der 1-ml-Spritze in die Mitte des Röhrchendeckels ein, saugen Sie die suspendierte Kolonie an und setzen Sie sie dann wieder in das MRS-Brühemedium aus. (Abbildung 1A (iv)).</li>
	<li>Inkubieren Sie das MRS-Brühemedium in einem Shaker-Inkubator für 2 Tage (37 °C, 5% CO2,200 U/min).</li>
	<li>Messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer, um Bakterienwachstumskurven zu überwachen, bis die Absorption bei OD620 bis 2,0 erreicht.</li>
	<li>Trennen Sie die Bakterienpellets und die konditionierten Medien durch Zentrifugieren bei 1.000 x g für 15 min. Waschen Sie die gesammelten Bakterienpellets mit 1x PBS und resuspendieren Sie in 4 ml RPMI 1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum. Fügen Sie keine Antibiotika in das Medium ein.</li>
	<li>Die Bakterienpellets in RPMI aufbewahren und in einem Shaker-Inkubator für 4 h bei 37 °C mit 5% CO2 bei einer Drehzahl von 100 U/min inkubieren.</li>
	<li>Zur Herstellung des probiotischen Überstandes das Bakterienpellet durch Zentrifugation bei 1000 x gfür 15 min bei 4 °C entfernen. Den zurückgewonnenen Überstand mit einem 0,22 μm Filter steril filtern und bis zur Verwendung bei −80 °C lagern.</li>
</ol>2. Erzeugung von Sphäroiden
<ol><li>
Vorbereitung von Darmkrebs-Zelllinien
	<ol>
<li>DlD-1-, HT-29- und WiDr-Zelllinien als Monoschichten bis zu 70-80% Konfluenz züchten und die Platte bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator (Wachstumsmedium: RPMI mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin) züchten.</li>
		<li>Für Zellen, die in einer 100-mm-Petrischale gezüchtet werden, waschen Sie die Platte zweimal mit 4 ml 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Petrischale für 2 min bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator, um die Zellen zu dissoziieren.</li>
		<li>Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zelldissoziation unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie Trypsin-EDTA mit 5 ml Wachstumsmedium.</li>
		<li>Die dissoziierten Zellen in ein 15 mL konisches Röhrchen und eine Zentrifuge für 3 min bei 300 x g geben.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und ruhen Sie ihn vorsichtig mit 3 ml Wachstumsmedium.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer zu bestimmen. (Abbildung 1B (i))</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sphäroide Bildung
	<ol>
<li>In einem konischen Röhrchen von 15 ml werden die Zellen von 2.1.5 verdünnt, um 1 - 2 x 105 Zellen/ml zu erhalten(Abbildung 1B (ii))</li>
		<li>Fügen Sie der Zellsuspension eine Endkonzentration von 0,6% Methylcellulose hinzu und übertragen Sie die verdünnten Zellen in ein steriles Reservoir. HINWEIS: Für jede Zelllinie sollte die benötigte Menge an Methylcellulose titriert und entsprechend bestimmt werden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μL Zellen in jede Vertiefung einer ultra-niedrigen 96-Well-Rundboden-Mikroplatte zu dosieren. (Abbildung 1B (iii))</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 24 - 36 h.</li>
		<li>Nach 24 - 36 h beobachten Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Sphäroidalbildung sicherzustellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Behandlung von 3D-Darmkrebszellen mit LCFS
<ol><li>Generieren Sie Sphäroide wie in den Schritten 2 und 3 beschrieben.</li>
	<li>Bevor Sie die LCFS-Behandlung durchführen, tauen Sie das gefrorene LCFS bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min auf.</li>
	<li>Impfen Sie die LCFS-Aktienlösung in ein Wachstumsmedium. Seriell verdünnt auf 25%, 12,5% und 6% im Wachstumsmedium (d.h. 25% LCFS = 150 μL Wachstumsmedium + 50 μL LCFS).</li>
	<li>Nehmen Sie die Zellkulturplatte mit Sphäroiden aus dem Inkubator und entfernen Sie mit einer 200 μL-Pipette so viel Wie möglich aus jeder Vertiefung.</li>
	<li>Die Wachstumsmedien mit LCFS auf die Zellen geben und bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 24 - 48 h inkubieren. HINWEIS: Das zu verwendende Volumen hängt wie folgt von der Plattengröße ab: 2 ml für 6-Well-Zellkulturplatten; 200 μL für 96-Well-Zellkulturplatten.</li>
</ol>4. Zelllebensfähigkeit für Sphäroide
<ol><li>Bereiten Sie 8 - 10 LCFS-behandelte Darmkrebssphäroide in undurchsichtigen Multi-Well-Platten vor (Zelllebensfähigkeitstests werden 48 Stunden nach der LCFS-Behandlung durchgeführt).</li>
	<li>Das Zelllebensfähigkeitsreagenz (siehe Materialtabelle)über Nacht bei 4 °C auftauen.</li>
	<li>Gleichen Sie das Zelllebensfähigkeitsreagenz vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur aus.</li>
	<li>Bevor Sie den Assay durchführen, entfernen Sie 50% der Wachstumsmedien aus den Sphäroide.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL Zelllebensfähigkeitsreagenz zu jeder Vertiefung hinzu. HINWEIS: Das zu verwendende Volumen hängt wie folgt von der Plattengröße ab: 100 μL für 96-Well-Zellkulturplatten.</li>
	<li>Mischen Sie das Reagenz 5 minuten lang kräftig, um die Zelllyse zu fördern.</li>
	<li>30 min – 2 h bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Lumineszenz auf.</li>
</ol>5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse für Sphäroide
<ol><li>Für jede Bedingung 10 - 15 Sphäroide in einem 2 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie für 3 min bei 400 x g.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Sphäroide zweimal in 1 ml eiskaltem 1x PBS. HINWEIS: Vermeiden Sie Zentrifugation, lassen Sie die Sphäroide sich absetzen.</li>
	<li>Saugen Sie so viel wie möglich von dem 1x PBS ab und isolieren Sie RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit.</li>
	<li>Synthetisieren Sie cDNA aus 1 μg RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Mastermix vor, um alle Proben in dreifacher Ausfertigung auszuführen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).</li>
	<li>Führen Sie die Verstärkung in einem 20 μL des Template-Master-Mixes in jede qPCR-Plattenbohrung durch.</li>
	<li>Mischen Sie die Reaktionen gut und drehen Sie sie bei Bedarf.</li>
	<li>Führen Sie Proben gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers aus (Tabelle 3).</li>
</ol>6. Westliches Blotting von Sphäroide
HINWEIS: Verwenden Sie beim Sammeln von Sphäroide eine 200 μL-Pipette und schneiden Sie das Ende der Spitzen ab, um deren Struktur nicht zu stören.
<ol><li>Bereiten Sie für jede Bedingung 30 - 40 Sphäroide in einem 2-ml-Röhrchen vor.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr auf Eis und lassen Sie die Sphäroide auf den Boden des 2-ml-Rohrs absetzen.</li>
	<li>Den Überstand entsorgen und die Sphäroide zweimal in 1 mL eiskalt 1x PBS waschen HINWEIS: Vermeiden Sie Zentrifugation, lassen Sie die Sphäroide sich absetzen.</li>
	<li>Saugen Sie so viel wie möglich von dem 1x PBS ab und fügen Sie RIPA-Puffer mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail hinzu (10 Sphäroide = 30 μL RIPA-Puffer).</li>
	<li>Lyse der Zellen durch Pipettieren auf und ab und führt eine Beschallung für 30 s durch, wobei 30 s 10 Zyklen lang auf Eis ruhen.</li>
	<li>Zentrifuge das Protein Lysate bei 15000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration für jedes Zelllysat.</li>
	<li>Vor dem Laden jedes Zelllysat in einem Probenpuffer bei 100 °C für 10 min kochen.</li>
	<li>Laden Sie gleiche Mengen Protein in die Vertiefungen des SDS-PAGE Gels und lassen Sie das Gel für 1 - 2 h bei 100 V laufen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Protein vom Gel auf die PVDF-Membran.</li>
	<li>Nach dem Transfer die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Sperrpuffer (5% Magermilch + TBS mit 0,05% Tween-20) blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 1:1.000 Verdünnungen des primären Antikörpers (Tabelle 4) in 1x TBST mit 5% BSA-Puffer bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, 15 min für jede Wäsche.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 1:2.500 Verdünnungen des sekundären Antikörpers im Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 2 h (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, 15 min für jede Wäsche.</li>
	<li>Bereiten Sie die Membran für den HRP-Nachweis mit einem chemiluminineszierenden Substrat vor.</li>
	<li>Erfassen Sie chemiluminineszierende Bilder.</li>
</ol>7. Propidiumiodid (PI) Färbung von Sphäroide
<ol><li>Bereiten Sie 5-10 Sphäroide wie in Schritt 4.1 beschrieben vor und legen Sie die Sphäroide in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.</li>
	<li>Verdünnen Sie eine 1 mg/ml Menge PI 1:100 in 1x PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie 50% des Mediums aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL der PI-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Vertiefungen für 10 - 15 min in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.</li>
	<li>Waschen Sie die PI-Lösung mit 1x PBS aus.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL Wachstumsmedium hinzu und nehmen Sie ein Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität mit Bild J, um die Lebensfähigkeit des Sphäroids zu erhalten.</li>
</ol>8. FACS-Analyse von Sphäroiden
<ol><li>Generieren Sie Sphäroide wie zuvor beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie für jede Bedingung 30 - 40 Sphäroide in einem FACS-Röhrchen und einer Zentrifuge für 3 minuten bei 400 x g und RT vor.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und waschen Sie die Sphäroide in 3 mL 1x PBS, dann zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 4 °C.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 200 μL 0,25% Trypsin-EDTA hinzu, dann inkubieren Sie es bei RT für 2 -3 min. HINWEIS: Die Inkubationszeit ist abhängig von der Sphäroidgröße und dem Zelltyp.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und dissoziieren Sie die Sphäroide vorsichtig mit einer 200 μL-Pipette.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 400 x g und 4 °C für 3 min. HINWEIS: FACS-Puffer = 1x PBS + 2,5% FBS, gefiltert mit einem 0,22 μm Top-Filter.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 7-AAD/Annexin V Reagenz (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/Probe) hinzu.</li>
	<li>Die Zellen vorsichtig durchwirbeln und 13 - 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 500 μL FACS-Puffer hinzu und filtern Sie die Zellen mit konischen Polystyrol-Reagenzgläsern, um Aggregatzellen zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 400 x g und 4 °C für 3 min.</li>
	<li>500 μL Annexin V-Bindungspuffer in jedes Röhrchen geben und wieder aufschnüssen.</li>
	<li>Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+in+adaptive+immune+homeostasis+and+disease.">The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease.</a> Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).</li><li>B&#225;rcena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthspan+and+lifespan+extension+by+fecal+microbiota+transplantation+into+progeroid+mice.">Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice.</a> Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).</li><li>Michalovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+disease+severity+magnify+disturbed+microbiome-immune+interactions+in+asthma+patients.">Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients.</a> Nature Communications. 10, 5711 (2019).</li><li>Ansaldo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+induces+intestinal+adaptive+immune+responses+during+homeostasis.">Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis.</a> Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).</li></ol>

Den Autoren sind keine relevanten finanziellen Angaben vor.

Die Gewebemikroumgebung, einschließlich benachbarter Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM), ist grundlegend für die Gewebeerzeugung und entscheidend für die Kontrolle des Zellwachstums und der Gewebeentwicklung13. 2D-Kulturen haben jedoch mehrere Nachteile, wie die Störung zellulärer Interaktionen sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, extrazellulären Umgebungen und dem Ansatz derDivision 14. 3D-Zellkultursysteme wurden gründlich untersucht, um In-vivo-E...

Probiotika sind die vorteilhaftesten Mikroorganismen im Darm, die die Immunhomöostase und den Energiestoffwechsel verbessern1. Probiotika aus Lactobacillus und Bifidobacterium sind die fortschrittlichsten ihrer Art, die im Darm gefunden werden2,3. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Lactobacillus hemmende und antiproliferative Wirkungen auf mehrere Krebsarten hat, einschließlich Darmkrebs4. Darüber hinaus verhindern Probiotika entzündliche Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa5,6. Die meisten Studien mit Probiotika wurden jedoch in zweidimensionalen (2D) Monoschichten durchgeführt, die auf festen Oberflächen gezüchtet werden.
Künstlichen Kultursystemen fehlen Umweltmerkmale, was für Krebszellen nicht natürlich ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Kultursysteme entwickelt7,8. Krebszellen in 3D zeigen Verbesserungen in Bezug auf grundlegende biologische Mechanismen wie Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Morphologie, Zell-Zell-Kommunikation, Arzneimittelempfindlichkeit und In-vivo-Relevanz9,10. Darüber hinaus werden Sphäroide aus mehrzelligen Arten von Darmkrebs hergestellt und sind abhängig von Zell-Zell-Interaktionen und der extrazellulären Matrix (ECM)11. Unsere vorherige Studie hat berichtet, dass probiotische zellfreie Überstände (CFS), die mit Lactobacillus fermentum hergestellt wurden, krebshemmende Wirkungen auf 3D-Kulturen von Darmkrebszellen (CRC) zeigten12. Wir schlugen vor, dass CFS eine geeignete alternative Strategie zum Testen probiotischer Wirkungen auf 3D-Sphäroideist 12.
Hier stellen wir einen Ansatz vor, der mehrzellige Arten von 3D-Darmkrebs für die Analyse der therapeutischen Wirkungen von probiotischen zellfreien Überständen (CFS) auf mehrere 3D-Darmkrebs-Mimikrysysteme aufnehmen kann. Diese Methode bietet ein Mittel zur Analyse verwandter probiotischer und krebshemmenden Wirkungen in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 &#181;l</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561036</td>
			<td>Pkg of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>100 covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x transfer buffer</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BT031A</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine (W/SDS)</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BT014</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SCT-200-C</td>
			<td>500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Lactobacilli MRS Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell viability assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>100&#956;l/assay in 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>vial of 20 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>25/Pack, 500/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 &#181;l rxns #1708890</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>25 x 20 &#181;L rxns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725121</td>
			<td>5 x 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus fermentum</td>
			<td>Korean Collection for Type Cultures</td>
			<td>KCTC 3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Cellulose (3500-5600mPa&#183;s, 2% in Water at 20&#176;C)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M0185</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td>20 plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640934</td>
			<td>100 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Introgen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Materials/Equipment/Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti - p-I&#954;B&#945; (B-9)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-8404</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BclxL (H-5)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-8392</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP 1 (C2-10)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-53643</td>
			<td>50 &#181;l ascites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>San Diego, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioT</td>
			<td>S1LFA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 ml</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 50 ml</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire Multimode Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Enspire 2300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Ashland, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-035-062</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>2.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Inc., San Diego, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000 mini</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated shaker</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SIF-6000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Gauge Ver. 3.0,</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>SPL</td>
			<td>60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile</td>
			<td>SPL</td>
			<td>21012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors</td>
			<td>SONICS-vibra cell</td>
			<td>VC 505</td>
			<td>500 Watt ultrasonic processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>COY LAB PRODUCTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating cell death using cell-free supernatant of probiotics in three-dimensional spheroid cultures of colorectal cancer cells

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bewertung des Krebszelltodes in dreidimensionalen (3D) Sphäroiden mehrzelliger Krebsarten unter Verwendung von Überständen aus der Lactobacillus fermentum Zellkultur, die als Probiotika-Kulturen betrachtet werden. Die Verwendung von 3D-Kulturen zum Testen von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS) ist eine bessere Option als tests in 2D-Monoschichten, zumal L. fermentum Krebsbekämpfungseffekte im Darm hervorrufen kann. Es wurde festgestellt, dass L. fermentum-Überstand unter 3D-Kulturbedingungen eine erhöhte antiproliferative Wirkung gegen mehrere Darmkrebszellen (CRC) besitzt. Interessanterweise waren diese Effekte stark mit dem Kulturmodell verbunden, was die bemerkenswerte Fähigkeit von L. fermentum zeigte, den Tod von Krebszellen zu induzieren. Stabile Sphäroide wurden aus verschiedenen CRCs (Darmkrebszellen) unter Verwendung des unten vorgestellten Protokolls erzeugt. Dieses Protokoll zur Erzeugung von 3D-Sphäroid ist zeitsparend und kostengünstig. Dieses System wurde entwickelt, um die krebshemmenden Wirkungen von LCFS in mehreren Arten von CRC-Sphäroiden leicht zu untersuchen. Wie erwartet, induzierten CRC-Sphäroide, die mit LCFS behandelt wurden, während des Experiments stark den Zelltod und exprimierten spezifische apoptose-molekulare Marker, die durch qRT-PCR, Western Blotting und FACS-Analyse analysiert wurden. Daher ist diese Methode wertvoll für die Erforschung der Zelllebensfähigkeit und die Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.

Wir beschreiben das Protokoll der Gewinnung von Sphäroiden aus verschiedenen Darmkrebszelllinien. Eine Supplementierung mit Methylcellulose war erforderlich, um Sphäroide zu erzeugen. Wir stellen auch eine Methode der LCFS-Vorbereitung vor und präsentieren ein Modell, um die Korrelation zwischen Probiotika und Darmkrebs zu untersuchen. Sphäroidbildungs- und LCFS-Präparationsprotokolle sind schematisch in Abbildung 1A,Bdargestellt. Wie in Abbildung 2...

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Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

evaluating-cell-death-using-cell-free-supernatant-probiotics-three

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.4K Aufrufe.  Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS). Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.

Serie: Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Forschung

Krebsforschung

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

Dreidimensionales biomimetisches In-vitro-Modell des Neuroblastoms unter Verwendung von kollagenbasierten Gerüsten

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...