Die hier vorgestellten Protokolle wurden für die 3D-Kultur optimiert und ermöglichen eine effiziente und erschwingliche Untersuchung von Prozessen im Zusammenhang mit Krebszellwachstum, Proliferation und Tod in einer 3D-Umgebung. Der Hauptvorteil der Verwendung von 3D-Kultur ist, dass sie eine einzigartige Möglichkeit sind, Schlüsselaspekte der Tumormikroumgebung in vitro zu rekapitulieren. 3D-Sphäroid ist ein wichtiges Instrument für das Screening von Krebsmedikamenten, das zunehmend zur Verbesserung der Übersetzung zwischen In-vitro- und In-vivo-Bedingungen in der Krebstherapieforschung eingesetzt wird.
Einige der Protokolle erfordern ein gewisses Maß an Übung und Geschick. Dies gilt insbesondere für die Herstellung von Sphäroiden nach der Handtropfenmethode und für das Einbetten von Sphäroiden für die Immunhistochemie. Da Schlüsselelemente dieser Verfahren schwer schriftlich zu beschreiben sind, wie z. B. das Einfügen von Sphäroiden in einen Tropfen Agarose, wird die visuelle Demonstration den Forschern helfen, diese Verfahren durchzuführen.
Verdünnen Sie die vorbereitete Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Rohr, um die optimale Zelldichte zu erhalten. Übertragen Sie die verdünnte Zellsuspension in ein steriles Reservoir und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter in die zuvor vorbereitete Platte. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit inkubieren.
Erfassen Sie alle zwei bis drei Tage lichtmikroskopische Bilder der Sphäroide. Nach dem Erfassen der Bilder, entfernen Sie 100 Mikroliter des verbrauchten Mediums aus jedem Brunnen, und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter frisches Medium. Zuerst, Tauwetter rekonstituierte Kellermembran auf Eis.
Halten Sie alle einzeln verpackten Platten und Reservoirs vor gebrauchen auf Eis. Als nächstes verdünnen Sie die vorbereitete Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Rohr, um die optimale Zelldichte zu erhalten. Legen Sie das Rohr mit der verdünnten Zellsuspension auf Eis.
Füllen Sie die Kunststoffbehälter mit Eis und geben Sie sie in die Haube. Übertragen Sie die gekühlten Platten und Reservoirs auf eine Zellkulturhaube. Legen Sie die Platten und Reservoirs wieder auf Eis.
Setzen Sie den rBM vorsichtig aus, um ein homogenes Gel zu gewährleisten. Fügen Sie die optimale Konzentration des rBM zu den gekühlten Zellsuspensionen hinzu. Invertieren Sie das Rohr, um sicherzustellen, dass die rBM und Zellsuspension richtig gemischt werden.
Dann übertragen Sie diese Mischung in ein steriles Reservoir, und verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 200 Mikroliter an jeden Brunnen einer gekühlten, ultra-niedrigen Befestigung, 96-Well-Platte zu verteilen. Zentrifugieren Sie die Platte 15 Minuten lang mit 750 mal g, um sicherzustellen, dass die Zellen zusammengegruppiert werden, wenn die rBM aushärtet. Verwenden Sie die Zentrifuge weichen Abstieg oder minimale Bremsfunktion.
Fügen Sie zunächst sechs Milliliter PBS zu einem Zellkulturgericht hinzu. Verdünnen Sie die vorbereitete Zellsuspension, um eine geeignete Verdünnung zu erhalten. Eine praktische Verdünnung beträgt 50.000 Zellen pro Milliliter.
Gießen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um bis zu 30 Tropfen Suspension vorsichtig in den Deckel der Zellkulturschale zu legen, was zu einer Konzentration von 2000 Zellen pro Tropfen führt. In einer schnellen, aber kontrollierten Bewegung, den Deckel umkehren und auf die Zellkulturschale legen, die PBS enthält. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit für vier bis sechs Tage inkubieren.
Wenn die Sphäroide für Proteinlysate oder Einbettungen verwendet werden sollen, ziehen Sie sie, indem Sie den Deckel entfernen, kippen und dann die Tropfen mit einem Milliliter erhitzten Mediums abwaschen. Übertragen Sie das resultierende sphäroidhaltige Medium auf ein 1,5 Milliliter-Rohr. Lassen Sie das Sphäroid auf den Boden der Röhre absetzen, bevor Sie mit Proteinlysaten oder Einbettungen fortfahren.
Schneiden Sie das Ende einer P200 Pipettenspitze, um die Sphäroide leichter einzufangen, ohne ihre Struktur zu stören. Ziehen Sie für jede Bedingung mindestens 12, aber idealerweise zwischen 18 und 24 Sphäroide in einem 1,5-Milliliter-Rohr. Legen Sie die Rohre auf Eis und lassen Sie die Sphäroide am Boden absetzen.
Als nächstes wechseln Sie vom sterilen Zelllabor in das reguläre Labor. Waschen Sie die Sphäroide zweimal in einem Milliliter eiskaltes X PBS, um die Sphäroide setzen zu lassen, bevor Sie die PBS zwischen jedem Waschschritt entfernen. Dann, aspirieren Sie so viel PBS wie möglich, ohne zu stören oder entfernen Sie die Sphäroide.
Fügen Sie fünf Mikroliter erhitzten Lysepuffer mit Phosphatase und Protease-Inhibitoren pro Sphäroid hinzu. Wirbeln Sie die Sphäroide für 30 Sekunden und führen Sie dann eine schnelle Zentrifugation für 10 Sekunden. Wiederholen Sie diese Wirbel- und Zentrifugationsintervalle für fünf bis zehn Minuten oder bis die Sphäroide aufgelöst sind.
Nach der Vorbereitung der PI-Lösung, entfernen Sie 100 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen in der 96-Well-Platte, stellen Sie sicher, dass die Sphäroide nicht zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter erhitzten X PBS zu jedem Brunnen hinzu, gefolgt von 100 Mikroliter Flüssigkeit aus den Brunnen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um das verbleibende Medium auszuwaschen.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der PI-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Bedecken Sie die Platte in Aluminiumfolie und brüten Sie für 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit für 10 bis 15 Minuten. Danach wiederholen Sie den Waschvorgang mit einem X PBS dreimal, wie zuvor beschrieben, um die PI-Lösung auszuwaschen und das Hintergrundsignal bei der Bildgebung zu verringern.
Mit einem Epifluoreszenzmikroskop die Sphäroide abbilden. Öffnen Sie innerhalb der Bildverarbeitungssoftware das Mehrkanalmenü. Legen Sie die Belichtungszeit für die entsprechenden Kanäle fest, und drücken Sie Leseeinstellungen, nachdem Sie jeden Kanal angepasst haben.
Öffnen Sie das Z-Stack-Menü und definieren Sie den Start und das Ende, indem Sie den Bildfokus anpassen. Zuerst haben Sie das Sphäroid aus dem Fokus, dann bewegen Sie den Brennpunkt durch das gesamte Sphäroid, bis das Bild wieder verschwommen wird. Passen Sie dann die Schrittgröße zwischen 18 und 35 Mikrometern an, und drücken Sie Start.
Um zu beginnen, fixieren Sie die Sphäroide in einer Dunstabzugshaube am ersten Tag, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie das Agarose-Gel am zweiten Tag in einen wassergefüllten Becher in einen Mikrowellenherd, um es zu erhitzen und das Gel auf einer auf 60 Grad Celsius eingestellten Tischheizungsplatte warm zu halten, bis es benötigt wird. Waschen Sie die Sphäroide zweimal in der Dunstabzugshaube mit einem Milliliter eiskaltem X PBS pro Wäsche.
Dann aspirieren Sie den größten Teil der PBS. Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze vor, indem Sie sie an einer Steigung schneiden, um eine Spitze mit einem größeren Loch zu erhalten. Danach machen Sie einen Agarose-Gel-Tropfen auf einem Mikroskop-Dia.
Legen Sie die Rutsche auf einen warmen Heizblock, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern. Mit der modifizierten Pipettenspitze möglichst viele Sphäroide in einem Volumen von 15 bis 20 Mikrolitern fangen. Injizieren Sie vorsichtig die Sphäroide in die Mitte des Agarose-Geltropfens, um sicherzustellen, dass das Mikroskop-Dia nicht berührt wird.
Bei Raumtemperatur oder bei vier Grad fünf bis zehn Minuten inkubieren, um das Agarose-Gel aushärten zu lassen. Wenn sich der Geltropfen etwas verfestigt hat, aber immer noch ziemlich weich ist, verwenden Sie ein Skalpell, um ihn vorsichtig vom Mikroskopinrutschen in eine Kunststoff-Gewebekassette zu schieben. Die Gewebekassette in einen mit Ethanol gefüllten Becher geben und bei Raumtemperatur lagern.
In dieser Studie wird eine Reihe von Methoden zur Analyse von krebsbehandlungsinduzierten Veränderungen der Lebensfähigkeit von Krebszellen und des Todes in der 3D-Kultur vorgestellt. Die Konzentration von rBM hinzugefügt kann die Morphologie der Sphäroide tiefgreifend beeinflussen. Die Zugabe von bis zu 2,5% rBM ermöglicht die Sphäroidbildung in SKBr-3 Brustkrebszellen ohne weitere Wirkung bei höheren Konzentrationen.
Im Gegensatz dazu bilden BxPC-3 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen spontan kleine kompakte Sphäroide. Bei diesem Zelltyp entlockt die Erhöhung des rBM auf 1,5% oder höher eine deutliche morphologische Veränderung von Sphäroid zu verworreneren Strukturen mit Vorsprüngen und Invaginationen. Ein Beispiel für die Verwendung von Sphäroidkulturen zum Screening der Chemotherapie-Wirksamkeit wird hier gezeigt.
Lichtmikroskopbilder werden alle zwei bis drei Tage während eines Dosisreaktionsexperiments aufgenommen, das durchgeführt wird, um die Dosis zu bestimmen, die für eine 50%reduzierte Lebensfähigkeit in MDA-MB-231 Brustkrebszellen erforderlich ist. Die räumliche Anordnung abgestorbener Zellen bei einer zunehmenden Konzentration eines Inhibitors kann mit PI-Färbung visualisiert werden. Wie gesehen, zeigen Kontrollsphäride einen begrenzten nekrotischen, späten apoptotischen Kern, während die abgestorbenen Zellen im Sphäroid verteilt sind, da die Konzentration des Inhibitors erhöht wird.
Die hier gezeigte Sphäroid-Technik kann auf viele andere Assays angewendet werden, wie 3D-Invasion, Migration oder mikrophoretische Analyse. Es ist auch anwendbar für Kokulturen mit Fibroblasten, Adipozyten oder Immunzellen, die wichtige Informationen über zelluläre Wechselwirkungen in der Tumormikroumgebung liefern können. Die Entwicklung dieser Technik war sehr wichtig, um die Rolle der Tumormikroumgebung in zahlreichen Aspekten der Krebsentwicklung zu klären, einschließlich Genexpression, Invasion und Behandlungshilfe.
