Die hier beschriebenen Brustkrebszellsphäroide werden es den Forschern ermöglichen, molekulare Mechanismen der Endothelzellinteraktionen von Krebszellen zu untersuchen, die an der Proliferation und Metastasierung von Krebszellen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses 3D-Modells besteht darin, dass es eine realistischere zelluläre Anordnung bietet, die die Zuverlässigkeit von Rückschlüssen auf die Pathophysiologie und Behandlung von Brustkrebs verbessert. Das Verfahren wird Giovanna Azzarito, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren.
Beginnen Sie mit der Behandlung oder Transfizierung der plattierten Zellen für 24 Stunden oder wie gewünscht. Um die Zellverteilung in Sphäroid zu identifizieren, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution oder HBSS, die Kalzium und Magnesium enthält, und bleiben Sie in HUVECs mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter blauem Farbstoff. Und MCF-7-Zellen mit 0,5 mikromolarem grünem Farbstoff, verdünnt in Bezug auf wachstumsmedium.
Legen Sie die Platte für 30 bis 40 Minuten in einen 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2-Inkubator. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium. Dann fügen Sie einen Milliliter enzymatisches Ablösungsmittel hinzu, das 0,25% Trypsin für HUVEC und 0,5% Trips in vier MCF-7 zu jeder braunen Schale mit einer P1000-Pipette ist.
Wählen Sie jeden Zelltyp separat in einem fünf Milliliter runden Boden-Polystyrolröhrchen und fügen Sie einen Milliliter 10% Fetal Calf Serum oder FCS-Medium mit einer P1000-Pipette hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 250 mal G für fünf Minuten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter steroidfreiem Medium.
Verwenden Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension, verdünnt mit 10 Millilitern Verdünnungsmittel 2, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen. Schalten Sie die Maschine ein und bündig, indem Sie die Funktions- und Starttasten drücken, mit Verdünnungsmittel 2 Lösung in einer Zellzählerfläschchen. Verwenden Sie als vier und drücken Sie Start, um den Rohling mit frischer Verdünnungsmittel 2-Lösung zu messen.
Wechseln Sie die Szintillationsfläschchen mit 100 Mikrolitern Zellsuspension in 10 Milliliter Verdünnungsmittel 2 Lösung. Verwenden Sie als vier eingerichtet und drücken Sie Start, um die Proben zu messen. Notieren Sie sich die Anzahl der Zellen pro Milliliter auf der Digitalanzeige, bereiten Sie dann fünf Milliliter jeder Zellsuspension vor und mischen Sie sie, um ein Endvolumen von 10 Millilitern im Verhältnis eins zu eins zu erhalten, wobei Sie eine manuelle Repetierpipette verwenden, um 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-U-Bodenplatte zu pipettieren.
Legen Sie die Platte unter Standardbedingungen der Gewebekultur in einen Inkubator und überprüfen Sie nach 48 Stunden die Bildung von Sphäroide. Machen Sie Bilder dieser Sphäroide mit 40-facher Vergrößerung mit einem Phasenkontrast- oder Fluoreszenzstereomikroskop. Zur Herstellung der hängenden Tropfenkultur mischen Sie die Zellsuspensionen im Verhältnis eins zu eins, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erhalten.
Verwenden Sie eine P20-Pipette, um die Zellmischung in Form von 15 Mikrolitertropfen auf der umgekehrten Leitung einer 10-Zentimeter-Petrischale zu sehen. Drehen Sie den Deckel mit den Tropfen um und fügen Sie fünf Milliliter EBM-2-Basismedium am Boden der Schüssel hinzu, um eine Verdunstung der Tropfen zu vermeiden. Sammeln Sie etwa 50 Sphäroide in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einer Darmspitze einer P200-Mikroliterpipette.
Lassen Sie sie sich durch Schwerkraft am Boden der Röhre absetzen und verwerfen Sie dann den Überstand. Fixieren Sie diese Sphäroide mit 500 Mikrolitern 4% PFA für eine Stunde bei Raumtemperatur. Kochen Sie 2% Nobel Algor Solution in PBS unter Verwendung einer Heizplatte mit einer magnetischen Rührung für drei bis fünf Minuten, um das augurösse Pulver vollständig aufzulösen und auf etwa 60 Grad Celsius abzukühlen.
Entfernen Sie die PFA mit einer P1000-Pipette, waschen Sie diese Sphäroide mit 500 Mikrolitern PBS und lassen Sie sie sedimentieren. Einmal abgesetzt, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig 600 Mikroliter Agora-Lösung in das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Sphäroide und legen Sie das Rohr sofort in eine Zentrifuge mit einem horizontalen Rotor bei 177 mal G für zwei Minuten. Fügen Sie eine kurze Schnur in der Mitte der Agro Solution hinzu, um den Stecker einfach aus dem Rohr zu entfernen.
Den Agros-Stecker auf Eis verfestigen oder bei vier Grad Celsius 500 Mikroliter PBS in das 1,5-Milliliter-Röhrchen geben, um ein Austrocknen des Pellets zu vermeiden. Erfassen Sie Bilder von Sphäroidschnitten mit einem Stereomikroskop. Berechnen Sie die Lösungsmenge, die erforderlich ist, um eine Mischung aus Calcium-Aam- und Ethidium-Homodimeren, die mit EBM-2 verdünnt wurden, in einem Verhältnis von eins zu 50 10 Mikroliter pro Vertiefung hinzuzufügen.
Fügen Sie die Färbemischung zu den Sphäroide hinzu und legen Sie die Platte in den Inkubator unter den Standardbedingungen der Gewebekultur für 30 bis 60 Minuten. Erfassen Sie Bilder mit 40-facher Vergrößerung mit dem Fluoreszenz-Stereomikroskop. In U-Bodenplatten wurde die Sphäroidbildung 48 Stunden nach der Aussaat von sieben MCF-Zellen beobachtet.
Die Sphäroidbildung wurde jedoch bei Endothelzellen oder Lymphzellen nicht beobachtet. Die Aussaat der MCF sieben plus Endothelzellen oder MCF sieben plus Lymphzellen im Verhältnis eins zu eins führte ebenfalls zur Bildung von Sphäroide. Das zeitabhängige sequentielle Wachstum von MCF sieben Sphäroiden wurde zwischen 24 und 120 Stunden aufgezeichnet.
Die Größe der Sphäroide stieg nach fünf Tagen von etwa 100 Mikrometern auf etwa 200 Mikrometer. Mit einer erhöhten Wachstumsrate, die in den mit dem Wachstumsstimulator behandelten Sphäroide beobachtet wurde. Die Struktur der Sphäroide und die Form ihrer Zellen zeigten keine Anomalien nach der Transfektion mit Kontroll-Oligonukleotiden in Gegenwart von Lipofektamin.
Zellen, die ihren proliferativen Marker Ki-67 exprimierten, waren homogen in diesen Sphäroiden verteilt. Drei Färbungen dieser Sphäroide zeigten nach vier Tagen Kultur apathische Zellen. Die Untersuchung der Zellen in diesen Sphäroiden mit CD-31 und Ki-67 ergab, dass 55% der Zellen epithelial sind, 45% endothelial sind und 25% der Zellen sich vermehren.
Um den Prozentsatz der lebenden und toten Zellen zu bestimmen, wurden vier Tage alte Sphäroide mit Calcium-Aam und Ethidium-Homodimer gefärbt. Ein frisch gedachter Sphäroidfleck, der auch tote und lebende Zellen färbt, zeigte, dass Sphäroide sehr empfindlich auf Frostbedingungen reagieren. Wenn Sie seinem Protokoll folgen, stellen Sie sicher, dass gesunde Zellen verwendet werden, um Aphrodite zu mischen Eine andere Sache, an die Sie sich erinnern sollten, wäre, diese Aphrodite während der DP-Kappe nicht zu beschädigen, um einen guten Abschnitt zu erhalten, der auch sicherstellt, dass die Aphrodite vor der Polymerisation am Gaumen ist.
Dieses Modell könnte weiter verbessert werden, indem andere Zellen, wie Fibroblasten, die an der Tumorprogression beteiligt sind, einbezogen und zur Bewertung der Wirksamkeit von Therapeutika verwendet wird, die auf ein Krebswachstum abzielen.
