Name: Serie: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions
Uploaded: 2020-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 3.2K Aufrufe. Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Wir danken Morgan Psenicka für die Bearbeitung und Diskussion des Manuskripts und Dr. Grahame Kidd für die Unterstützung bei der Formatierung der Abbildungen. Diese Arbeit wurde von NIAID K22 AI125466 (JLW) unterstützt.

HINWEIS: Alle Tierstudien wurden vom Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und genehmigt.
1. Bereiten Sie Medien und Vorräte für das Sezieren vor
HINWEIS: Alle Puffer- und Medienrezepte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Dieses Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einer als Biosicherheitswerkbank bezeichneten Gewebekultur durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie gemischte Gliamedien (MGM) vor und filtern Sie sie steril. Dies kann am Vortag erfolgen und bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie Fibronektin in einer Konzentration von 1:100 mit sterilemH2O. Das Volumen des verdünnten Fibronektins hängt von der Anzahl der Welpen und der ZNS-Region ab, die für das Experiment verwendet wurden. Verwenden Sie einen T25-Kolben für 1 Kortex, einen T25-Kolben für 2-4 Großhirn, einen T25-Kolben für 2-4 Hirnstängel und einen T25-Kolben für 2-4 Rückenmarks. HINWEIS: Die Kombination von Gewebe aus derselben Region unter Verwendung der oben aufgeführten Kriterien ermöglicht eine angemessene Dissoziation, ohne das unten beschriebene Protokoll zu ändern. Die Kombination von mehr Gewebe als in Schritt 1.2 beschrieben erfordert eine weitere Optimierung der Dissoziationsreagenzienkonzentrationen.</li>
	<li>3 ml verdünntes Fibronektin in T25-Kolben bei Raumtemperatur pipettieren und 2 min einwirken lassen.</li>
	<li>Das Fibronektin absaugen und die Kolben über Nacht trocknen lassen, wobei der Kolbendeckel gelöst ist.</li>
</ol>2. Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksdissektion
HINWEIS: Dieser Vorgang kann auf dem Tischgerät durchgeführt werden und erfordert einen Sezierbereich. Verwenden Sie strenge aseptische Technik für alle Schritte des Verfahrens und minimieren Sie die Exposition des Gewebes gegenüber der Raumluft. Bewahren Sie alle Medien während der Dissektion auf Eis gekühlt auf, um eine maximale Gewebekonservierung zu gewährleisten. Alternativ könnte dieses Verfahren in einer Haube durchgeführt werden, die die Verwendung eines internen Sezierbereichs ermöglicht.
<ol><li>Wischen Sie alle Bereiche mit 70% Ethanol ab.</li>
	<li>10 ml PBS/Antibiotikalösung (PAS) in eine 10 cm Petrischale pipettieren. Bereiten Sie eine Petrischale für jeden Welpen vor, der seziert werden soll. Auf Eis legen, um die Lösung gekühlt zu halten.</li>
	<li>In einer desinfizierten Gewebekulturhaube 9 ml DMEM (ohne Zusatzstoffe) in 4 separate 15-ml-konische Röhrchen pipettieren, eines für jede ZNS-Region, Schlauchkappen ersetzen und auf Eis legen. Platzieren Sie den Eiskübel mit Röhrchen in Reichweite des Sezierzielfernrohrs.</li>
	<li>Legen Sie die in Schritt 2.2 vorbereitete 10-cm-Petrischale auf die desinfizierte Dissektionsstufe.</li>
	<li>Betäuben und euthanasieren Sie Mäusewelpen gemäß dem institutionellen Protokoll und entfernen Sie den Kopf durch schnelle Enthauptung mit einer scharfen Schere. HINWEIS: Postnatale Tag (P) 3-5 Welpen werden verwendet. Ältere Welpen haben ein stärker entwickeltes ZNS und sind möglicherweise keine ausreichende Quelle für expandierende Gliazellen. Jüngere Welpen (P) 0-2 können eine höhere Anzahl von Gliazellen ergeben und können verwendet werden; Allerdings ist Rückenmarksgewebe in diesem jungen Alter aufgrund der Größe sehr schwer zu sezieren.</li>
	<li>Reinigen Sie die Haut des Welpen mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer feinen Schere die Hautschicht entlang der Mittellinie des Kopfes des Tieres, beginnend kaudal und rostral bewegend, bis Sie die Schnauze erreichen. Vermeiden Sie es, tief in den Schädel zu schneiden, um Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Den Kopf nach unten neigen, Hautschicht zu jeder Seite des Schädels ziehen und mit einer Federschere einen Schnitt entlang der Schädelmittellinie machen, beginnend am Foramen magnum, wieder kaudal zu rostral schneidend.</li>
	<li>Ziehen Sie mit einer feinen Pinzette die Schädelhälften nach rechts und links und legen Sie den Kortex, das Kleinhirn und den Hirnstamm frei.</li>
	<li>Nach der Freilegung heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel und in die 10 cm große Petrischale, die in Schritt 2.2 vorbereitet wurde. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn unbeschädigt bleibt, um die anatomische Struktur zu erhalten, wobei das Hinterhirn angebracht ist.</li>
	<li>Mit einer feinen, gebogenen Pinzette, bei der die Spitze der Pinzette nach oben zeigt, klemmen Sie das Kleinhirn ab. Entfernen Sie die Hirnhäute und legen Sie sie in ein 15-ml-konisches Röhrchen in den Eiskübel.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Hirnstamm direkt ventral zum Kleinhirn ist und nach Entfernung des Kleinhirns sichtbar ist. Entfernen Sie es mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Hirnhäute und legen Sie es in ein dafür vorgesehenes 15-ml-konisches Röhrchen im Eiskübel.</li>
	<li>Trennen Sie das Mittelhirn vom Kortex, entfernen Sie kortikale Hirnhäute und legen Sie es in eine bestimmte 15-ml-konische Röhre im Eiskübel.</li>
	<li>Um das Rückenmark zu entfernen, legen Sie den enthaupteten Mäusewelpen in Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben liegend) mit der durchtrennten Wirbelsäule in Richtung des Prüfers.</li>
	<li>Erneut mit 70% Ethanol besprühen.</li>
	<li>Schneiden Sie entlang der seitlichen Seiten der Wirbelsäule in rostraler bis kaudaler Richtung durch den Brustkorb bis zu den Hintergliedmaßen. Drücken Sie beim Schneiden die inneren Organe zurück, bis die Wirbelsäule sichtbar ist.</li>
	<li>An jeder Seitenseite der Wirbelsäule abgeschnitten, bis sie isoliert ist, und in die in Schritt 2.2 vorbereitete 10 cm große Petrischale geben.</li>
	<li>Mit der Bauchseite nach oben und mit einer feinen Federschere abwechselnd die rechte und linke Seite jedes Wirbels schneiden, bis die Lendengegend erreicht ist, um das Rückenmarksgewebe freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Rückenmark und die Hirnhäute mit einer feinen Pinzette unter dem Seziermikroskop. In das dafür vorgesehene 15-ml-konische Rohr im Eiskübel geben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.5.-2.19 für jedes Welpen und kombinieren Sie Gewebe aus derselben Region, um die in Schritt 1.2 beschriebenen Kriterien für jeden vorbereiteten T25-Kolben zu erfüllen. HINWEIS: Entfernen Sie die Hirnhäute so vollständig wie möglich. Wenn eine signifikante Menge an Hirnhäuten verbleibt, wächst der fibroblastenartige Phänotyp der Meningealzellen aus und überwältigt die Zellkultur. Mehrere Rückenmarks, mit gleichem Phänotyp, können kombiniert werden, um eine spezifische Zellkultur zu erzeugen. Achten Sie darauf, dass es nicht zu einer Überfüllung der Zellen kommt, die zu Glia-Apoptose und differentiellen Phänotypen führen kann.</li>
</ol>3. Gewebedissoziation
HINWEIS: Alle folgenden Verfahren werden in einer sterilen Gewebekultur, die als Biosicherheitswerkbank bezeichnet wird, unter Verwendung aseptischer Technik und steriler Materialien durchgeführt.
<ol><li>Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin mit 0,53 mM EDTA zu jedem 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml DMEM und Gewebe hinzu, um die Gewebelyse zu beginnen. HINWEIS: DMEM enthält eine hohe Menge an Calciumchlorid, das als Inhibitor von Trypsin wirken kann. Wenn die Dissoziation nach den beschriebenen Schritten nicht abgeschlossen ist, kann Hanks' Balanced Salt Solution ohne Kalzium oder Magnesium verwendet werden. Nach der Trypsinisierung kann das Enzym durch Zugabe eines Trypsininhibitors neutralisiert werden, obwohl Kalzium wieder in die Lösung gegeben werden sollte, da es ein Cofaktor für DNase I ist, der in nachfolgenden Schritten verwendet wird.</li>
	<li>Triturate mit einer 10 ml Pipette ca. 20x.</li>
	<li>Die Zellsuspensionen werden in leere 50 ml konische Röhrchen überführt.</li>
	<li>Die Lösung bei 37 °C, 5%CO2 für 15 min inkubieren, die Lysate nach 8 min sanft rühren.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml MGM und 200 μL (5 mg/ml) DNase I zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu erhalten.</li>
	<li>Trituieren Sie jedes Lysat mit einer 10 ml Pipette 10x.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellsuspensionen 3 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, damit sich nicht dissoziiertes Gewebe am Boden der Röhrchen absetzen kann.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspensionen in neue 50 ml konische Röhrchen und hinterlassen Sie das nicht dissoziierte Gewebe. HINWEIS: Die oben beschriebenen Lyse- und Verreibungsschritte begrenzen die Menge an nicht dissoziiertem Gewebe erheblich.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 3 min bei 4 °C ohne Bremse.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die verbleibenden Zellpellets in 5 ml MGM.</li>
	<li>Trituieren Sie das Pellet mit einer 5 ml Pipette 20x.</li>
	<li>Die 5-ml-Zellsuspensionen werden auf beschichtete T25-Kolben aufgetragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 und wechseln Sie das Medium zunächst nach 24 h, um Zelltrümmer zu entfernen. HINWEIS: Einige Protokolle empfehlen einen ersten Medienwechsel nach 72 h. Eine Optimierung dieses Schritts kann erforderlich sein.</li>
	<li>Führen Sie alle 48-72 h einen 100%igen Medienwechsel mit MGM durch, bis die Zellen zu 80% konfluent sind (ca. 5-7 Tage). HINWEIS: Alle Medien müssen vor dem Medienwechsel auf 37 °C erwärmt werden.</li>
</ol>4. Mikroglia Isolierung
<ol><li>Sobald gemischte Gliakulturen einen Zusammenfluss von 80% erreicht haben, bereiten Sie die Kolben für das Schütteln vor, indem Sie die Deckel festziehen und mit Paraffinfolie verschließen.</li>
	<li>Um Mikroglia aus gemischten Gliakulturen zu entfernen, befestigen Sie die Kolben horizontal auf einem Orbitalschüttler in einem 37-°C-Inkubator. Schütteln Sie die Kolben bei 15 x g für 1 h.</li>
	<li>Medien entnehmen und in ein 15-ml-konisches Röhrchen pipettieren. Spülen Sie die Kolben zweimal mit 3 ml warmem MGM ab und fügen Sie den 15-ml-konischen Röhrchen Wäsche hinzu. Dies sind die Mikroglia.</li>
	<li>5 ml warmes, frisches MGM in die Kulturkolben geben.</li>
	<li>Kolben mit Paraffinfolie wieder verschließen, Kolben horizontal auf dem Schüttler verschließen und bei 15 x g bei 37 °C für 15 h schütteln, um OPCs von Astrozyten zu trennen. HINWEIS: Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, aber die 15-stündige Schüttelzeit ist kritisch, da überschüssige Zeit zum Zelltod führen kann.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand aus Schritt 4.3. bei 300 x g für 3 min und Kultur Mikroglia gemäß Standardprotokoll16 oder Verwendung für einen biologischen Assay.</li>
</ol>5. Isolierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
HINWEIS: Bei der Beschichtung von OPCs nach der Erstisolierung müssen diese auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche (sterile Platte oder Deckglas) plattiert werden. Bereiten Sie diese Materialien vor Abschluss dieses Abschnitts vor.
<ol><li>Nach 15 h Schütteln den Überstand aus den Kolben nehmen und auf einer sterilen 100-mm-Petrischale aufschlagen.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Überstand bei 37 °C, 5%CO2 für 30 min, schwenken Sie nach 15 min, um die verbleibenden Mikroglia zu entfernen, da diese sehr schnell an der Schale haften. Für diesen Schritt können nicht gewebekulturbehandelte Petrischalen verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den nicht adhärenten Zellüberstand, die Zählung und die Platte auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche. Typischerweise werden 7.500-10.000 OPCs plattiert/cm2.</li>
	<li>Bei 37 °C, 5%CO2 für mindestens 1 h (bis zu 6 h) inkubieren, dann 95% der Medien vorsichtig absaugen und langsam warme OPC-Medien hinzufügen, wobei Medien gegen die Wand des Bohrlochs pipettiert werden, um die Störung von OPCs zu minimieren. Wechseln Sie die Medien alle 48 Stunden, bis die Zellen einsatzbereit sind. HINWEIS: Es ist wichtig, dass jeweils nur ein Bohrloch gewechselt wird. OPCs sind empfindlich und besonders intolerant gegenüber trockenen Bedingungen. Die Zugabe von PDGF-AA in OPC-Medien soll die OPC-Reifung zu Oligodendrozyten verzögern. Dieser Faktor kann aus Kulturmedien ausgeschlossen werden, wenn der experimentelle Fokus auf reifen Oligodendrozyten liegt.</li>
</ol>6. Astrozyten-Isolierung
<ol><li>Nach 15 h Schütteln den Überstand entfernen und die Kolben 2x mit warmem 1x PBS abspülen.</li>
	<li>4 ml 0,05% Trypsin mit 0,53 mM EDTA zugeben und bei 37 °C, 5%CO2 für 5 min oder bis sich die Zellen gehoben haben, inkubieren. Um sicherzustellen, dass sich die Astrozyten gehoben haben, visualisieren Sie sie mit einem Standard-Weitfeldmikroskop. Astrozyten erscheinen nach der Trypsinisierung kugelförmig.</li>
	<li>Sobald sich die Astrozyten gelöst haben, stellen Sie den Kolben senkrecht und fügen Sie 4 ml MGM hinzu. Triturate zum Mixen.</li>
	<li>Astrozyten in ein 15 ml konisches Röhrchen pipettieren, bei 300 x g für 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie Astrozyten in Astrozytenmedien und Platten auf fibronektinbeschichteter Oberfläche wie in Schritt 1.2 beschrieben. oder Verwendung für biologische Assays. HINWEIS: 20 ng / ml muriner Fibroblasten-Wachstumsfaktor kann während des ersten Medienwechsels hinzugefügt werden, um die Etablierung der Astrozytenkultur zu unterstützen. Darüber hinaus kann eine Standardgelatinebeschichtung eine kostengünstige Alternative zu Fibronektin sein.</li>
</ol>7. Identifizierung und Isolierung von Mikroglia, OPCs, Astrozyten und reifen Oligodendrozyten mittels Immunzytochemie
<ol><li>Sobald die plattierten Zellen die entsprechende Konfluenz erreicht haben, entfernen Sie vorsichtig Medien und fixieren Sie die adhärenten Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten. Führen Sie diesen Schritt in einer Biosicherheitswerkbank aus. HINWEIS: Wenn Sie Lösungen absaugen oder hinzufügen, pipetten Sie mit leichtem Druck, um eine Zellablösung zu verhindern.</li>
	<li>PFA langsam absaugen und dann die Zellen 3x mit 1x PBS für 5 min waschen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine geeignete Blocklösung mit 10% Serum und 0,1% Triton X-100 in 1x PBS vor. HINWEIS: Die Serumquelle spiegelt das Wirtstier wider, bei dem der sekundäre Antikörper hochgezogen wurde. Wenn der sekundäre Antikörper beispielsweise Ziegen-Anti-Kaninchen ist, ist das geeignete blockierende Serum normales Ziegenserum. Ebenso, wenn der sekundäre Antikörper Esel Anti-Kaninchen ist, sollte das blockierende Serum normales Eselserum sein.</li>
	<li>Fügen Sie eine blockierende Lösung hinzu, bis die Zellen vollständig bedeckt sind. Block für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Antikörperverdünnungslösung her (9 ml 1x PBS, 0,01 g Rinderserumalbumin, 30 μL Triton X-100). Alternativ können Antikörper in der in Schritt 6.3 beschriebenen Blocklösung verdünnt werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie primäre Antikörper, die spezifisch für Folgendes sind, in Antikörperverdünnungs- oder Blockierungslösung:<ol><li>Mikroglia: ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1 (Iba1) in einer Verdünnung von 1:250 (2,4 μg/ml).</li>
		<li>OPCs: Neural-/Gliaantigen 2 (NG2) in einer Verdünnung von 1:200 (5 μg/ml).</li>
		<li>Reife Oligodendrozyten: Myelin-Basisprotein (MBP) in einer Verdünnung von 1:400 (Konzentration ist chargenabhängig und eine Optimierung kann erforderlich sein).</li>
		<li>Astrozyten: saures Gliafibrillenprotein (GFAP) in einer Verdünnung von 1:400 (0,25 μg/ml)17. HINWEIS: Mischen Sie keine primären Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden. HINWEIS: GFAP markiert zuverlässig Astrozyten der weißen Substanz. Für Astrozyten der grauen Substanz muss möglicherweise ein alternativer Marker verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Primärer Antikörper über Nacht bei 4 °C inkubieren (mit leichtem Rühren ist wünschenswert).</li>
	<li>3x mit 1x PBS für 5 min waschen, um den primären Antikörper zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen mit geeigneten sekundären Antikörpern in einer Verdünnung von 1:400 in lichtgeschützter Antikörperverdünnungs- oder Blocklösung. HINWEIS: Sekundäre Antikörper werden an ein Fluorophor konjugiert, das je nach verfügbaren Mikroskopparametern ausgetauscht werden kann. Sobald fluoreszierende sekundäre Antikörper aufgetragen wurden, so weit wie möglich vor Licht schützen.</li>
	<li>Inkubieren Sie sekundäre Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur und begrenzen Sie die Lichtexposition.</li>
	<li>3 mal mit 1x PBS für 5 min waschen, um überschüssige sekundäre Antikörper zu entfernen.</li>
	<li>Um Kerne zu markieren, verwenden Sie eine 1:1.000 DAPI/PBS-Lösung und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>3x mit 1x PBS 5 min im Dunkeln waschen.</li>
	<li>Zur Montage Montagemedien auftragen und vor der Aufnahme im Dunkeln trocknen lassen. HINWEIS: Gerahmte Dias können 2-3 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Für eine Langzeitlagerung die Dias auf 4 °C verschieben. Bild innerhalb einer Woche für maximales Signal. Alle repräsentativen Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen; Es werden jedoch auch inverse Fluoreszenzmikroskope empfohlen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben Interessenkonflikte offenzulegen.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung der drei wichtigsten Gliazellsubpopulationen aus dem Maus-ZNS: Mikroglia, OPCs und Astrozyten. Ein großer Rückschlag für die Untersuchung neurodegenerativer und neuroinflammatorischer ZNS-Erkrankungen ist der Mangel an primären menschlichen Zellen und Geweben, insbesondere solchen, die regional sind und vom selben Patienten stammen. In den meisten Fällen stammen menschliche ZNS-Zelllinien von transformierten, immortalisierten Krebszellen, die möglicherweise keine genauen Darstellungen ihres normalen physiologischen Verhaltens darstellen20,21,22. Daher sind alternative Methoden notwendig, um ZNS-Zellphänotypen kontrolliert zu untersuchen. Darüber hinaus macht es die Vielfalt neurologischer Gliazellpopulationen notwendig, jeden Subtyp sowohl unabhängig voneinander als auch unter Kokulturbedingungen zu untersuchen, um sowohl ihre zellautonomen als auch ihre nicht-autonomen Funktionen zu rekapitulieren. Gliazellen haben eine Vielzahl kritischer Funktionen im ZNS, die von neuronaler Unterstützung23, Lernen/Kognition24,25 und immunologischen Reaktionen des ZNS26 reichen. Daher ist es notwendig, die molekularen und zellulären Funktionen jeder glialen Subpopulation in einem physiologischen und pathologischen Kontext zu verstehen. Um dies zu tun, stellen wir hier eine zuverlässige Methode zur Extraktion und Isolierung lebensfähiger Glia-Subtypen zur Verfügung. Aufgrund praktischer und ethischer Einschränkungen in der Forschung am Menschen sind Tiermodelle derzeit die relevantesten Surrogate für die menschliche Gliazellbiologie. Insbesondere Mäuse sind ideale Modelltiere, da ihr Genom manipuliert und analysiert werden kann, um bestimmte molekulare Mechanismen, die Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen, weiter zu analysieren. Daher ist die erfolgreiche Entfernung und Trennung von murinen Mikroglia, OPCs und Astrozyten ein Schlüsselwerkzeug, um die Funktionen von Gliazellen bei physiologischen, neurodegenerativen oder neuroinflammatorischen Erkrankungen zu untersuchen.
Dieses Protokoll kann optimiert werden, um die regionale Heterogenität von ZNS-Zellen zu untersuchen. Es wird immer deutlicher, dass Gliazellen regionale Heterogenität in Form und Funktion aufweisen. Astrozyten sind regional vielfältig und zeigen je nach Lage im ZNS27 eine unterschiedliche Morphologie. Darüber hinaus können die Dichte der Astrozyten und ihr mitotischer Index anatomische Regionen definieren, was die Hypothese unterstützt, dass die regionale Astrozytenheterogenität molekulare und funktionelle Unterschiede aufgrund ihrer Position innerhalb des ZNSwiderspiegeln kann 28. Die regionale Heterogenität der Mikroglia wird ebenfalls aktiv untersucht, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen und funktionellen Konsequenzen der Mikroglia-Diversität bei der Entwicklung oder dem Verhalten des ZNS derzeit unklar sind. Es ist jedoch bekannt, dass adulte Mikroglia Diversität in Zellzahl, Zell- und subzellulären Strukturen und molekularen Signaturen aufweisen29. Darüber hinaus haben die jüngsten Fortschritte in der Multiplex-Massenzytometrie die regionale Heterogenität von Mikroglia weiter definiert, indem der zelluläre Phänotyp aus fünf verschiedenen ZNS-Regionen von neun menschlichen Spendern analysiert wurde, was eine groß angelegte Immunphänotypisierung menschlicher Mikroglia ermöglicht30. Derzeit befinden sich solche Ansätze in einem Anfangsstadium, was Tierstudien zu einer praktikablen Lösung für die Untersuchung regionaler Glia bei der Entwicklung von ZNS-Erkrankungen macht. Schließlich wurde kürzlich auch regionale Heterogenität in Oligodendrozyten beschrieben. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung an 5072 Einzelzellen aus 10 Regionen des juvenilen und adulten ZNS identifizierte 13 verschiedene Subpopulationen in verschiedenen Differenzierungsstadien31. Wichtig ist, dass mit der Reifung von Oligodendrozyten aus OPCs ihre Transkriptionsprofile divergierten und sich ihre funktionellen Phänotypen veränderten, was die Oligodendrozytenheterogenität innerhalb des ZNSunterstreicht 31.
Daher kann das Verständnis der regionalen Heterogenität der verschiedenen residenten ZNS-Zellen im Kontext ihrer verschiedenen benachbarten Neuronen und anderer Gliazellen wichtige Gründe für die zukünftige Entwicklung neuartiger Therapien zur Behandlung neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Erkrankungen liefern. Während sich dieses Protokoll auf die Extraktion, Isolierung und Identifizierung von Gliasubpopulationen konzentriert, bietet es einen geeigneten Ausgangspunkt für die Untersuchung ihrer Funktion. Darüber hinaus kann es angepasst und mit transgenen Mausmodellen kombiniert werden, um genetische Mechanismen der Gliazellbiologie zu untersuchen. Es kann auch verwendet werden, um die Reaktionen von Gliazellen aufeinander in Co-Kultur-Assays zu untersuchen. Die skizzierten Schritte stellen eine kostengünstige Hochdurchsatzmethode zur Extraktion und Isolierung verschiedener ZNS-Gliapopulationen dar, die dann an eine Vielzahl von experimentellen Parametern angepasst werden können. Es sollte beachtet werden; Die hier beschriebene Methode verwendet jedoch Neugeborene aufgrund der geringeren Myelinisierung und der hohen Dichte der proliferierenden Glia. Aus diesen Gründen ist es technisch machbarer, lebensfähige Gliazellen aus Neugeborenen im Vergleich zu erwachsenen Tieren zu isolieren. Die phänotypischen Unterschiede zwischen neonataler Glia und adulter Glia sollten daher bei der experimentellen Planung und Dateninterpretation berücksichtigt werden.

Glia sind notwendig für die richtige neuronale Funktion im ZNS. Sie bestehen aus drei Hauptsubpopulationen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die jeweils eine andere, aber unverzichtbare Rolle spielen1. Ohne die richtige Gliazelldiversität und -aktivität würde die neuronale Funktion stark beeinträchtigt, was zu einer Beeinträchtigung des ZNS führen würde. Glia sind in der Lage, die Neurotransmission zu beeinflussen, und jeder Zelltyp tut dies auf einzigartige Weise. Gliazellen im Gehirn haben die Fähigkeit, sowohl untereinander als auch mit neuronalen Zellen zu kommunizieren, um die richtige ZNS-Funktion zu erleichtern2. Oligodendrozyten erhöhen die Geschwindigkeit der elektrischen Übertragung durch die Bildung einer Myelinscheide, die die Clusterbildung von Ionenkanälen an den Knoten von Ranvier, den Orten der neuronalen Aktionspotentialerzeugung3, erleichtert. Mikroglia sind entscheidend für die Beschneidung von Synapsen, indem sie die synaptische Übertragung überwachen und neuronale Verbindungen nach Verletzungen "neu verdrahten"4. Darüber hinaus sind Mikroglia die am häufigsten vorkommenden residierenden Immunzellen des ZNS und fungieren als primäre Form der Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger5. Astrozyten können die synaptische Übertragung zwischen Neuronen regulieren, indem sie die Konzentration des extrazellulären Kaliumsverändern 6. Sie spielen auch eine Rolle bei der Kontrolle des lokalen Blutflusses7, der Freisetzung und Aufnahme neuromodulatorischer Elemente8 und spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke9. Daher ist jeder gliale Subtyp entscheidend für die ZNS-Funktion, da Defekte in jeder Art seit langem mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht werden, einschließlich psychiatrischer Erkrankungen, Epilepsie und neurodegenerativer Erkrankungen10.
Das größte Hindernis bei der Erforschung der ZNS-Pathobiologie ist die Unfähigkeit, menschliche Zellen im Kontext ihrer mikroökologischen Nische zu untersuchen. Menschliches Biopsiegewebe wird am häufigsten postmortal entnommen und Zellen können während der Extraktion und Verarbeitung leicht beschädigt werden oder verloren gehen. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, menschliche Zellen in vitro für längere Zeit am Leben und lebensfähig zu halten, ohne immortalisierte Zelllinien aus Tumoren abzuleiten, an denen sie ihre normalen physiologischen Eigenschaften nicht mehr genau widerspiegeln11,12. Darüber hinaus gibt es eine signifikante regionale Heterogenität zwischen den einzelnen Gliazelltypen13,14,15, und die Gewinnung regionaler ZNS-Proben von einzelnen Patienten ist nahezu unmöglich. Daher ist es notwendig, alternative Modelle zu entwickeln, um den Beitrag regionaler Glia bei spezifischen ZNS-Erkrankungen zu untersuchen.
Hier beschreiben wir ein in vitro System, das die regionsspezifische Isolierung mehrerer Gliasubpopulationen der Maus verwendet, was die Manipulation und Quantifizierung von Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs), aus denen reife Oligodendrozyten hervorgehen, und Astrozyten ermöglicht. Jede Population kann unabhängig voneinander isoliert und einer Vielzahl von experimentellen Techniken unterzogen werden, einschließlich Arzneimittel- oder Molekülbehandlung, Immunzytochemie, Protein- / RNA-Extraktion und -Analyse und anderen Kokultursystemen, je nach experimenteller Notwendigkeit. Darüber hinaus liefert diese Isolationstechnik eine hohe Zellzahl, die die Charakterisierung und Untersuchung jeder Gliapopulation im Hochdurchsatz ermöglicht. Es ermöglicht auch die Untersuchung der ZNS-Zelldifferenzierung, des Wachstums und der Proliferation als Reaktion auf eine Vielzahl von Mikroumweltreizen auf kontrollierte Weise, um Störfaktoren zu vermeiden, die typischerweise in einer In-vivo-Umgebung vorhanden sind. Schließlich erleichtert diese Zellisolierungstechnik die Manipulation von Gliazellpopulationen in verschiedenen ZNS-Regionen, um zu untersuchen, wie regionale Gliazellen miteinander interagieren und auf unterschiedliche Reize reagieren, was Präzision und Reproduzierbarkeit ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>12-Well Plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td>Cell culture plate</td></tr><tr><td>1X PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Standard reagent</td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>50 mL, 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; cell culture flask</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>Cell culture (T25) flask</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Media component</td></tr><tr><td>B-27 Supplement 50X</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647-50G</td><td>Antibody diluent</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td>Confocal for imaging</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Nuclear stain</td></tr><tr><td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>A3840001</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-1MG</td><td>Cell adherent</td></tr><tr><td>Fine stitch Scissors</td><td>Sklar</td><td>64-3260</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Secondary staining antibody</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21434</td><td>Secondary staining antibody</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td><td>ThermoFisher</td><td>14170120</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200mM</td><td>Gibco</td><td>20530081</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Murine epidermal growth factor</td><td>ThermoFisher</td><td>PMG8044</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>315-05-20UG</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Murine PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>315-17</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Blocking solution component</td></tr><tr><td>Operating Scissors</td><td>Surgi-OR</td><td>95-272</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td><td>Corning Biocoatt</td><td>354086</td><td>Cell adherent</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9071S</td><td>Mounting Media</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td><td>Millipore</td><td>ab5320</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Rat anti-GFAP</td><td>ThermoFisher</td><td>13-0300</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Rat anti-myelin basic protein</td><td>Abcam</td><td>ab7349</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Sharp Tip Scissors</td><td>Surgi-OR</td><td>95-104</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Leica</td><td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td><td>Microscope for dissection</td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Sklar</td><td>66-7644</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-100</td><td>Cell permabilization</td></tr><tr><td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td><td>Sigma</td><td>10109878001</td><td>Tissue dissociation</td></tr></tbody></table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

Die hier vorgestellten Methoden demonstrieren Laborverfahren zur Dissektion von vier verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems (ZNS) von murinen Neugeborenen zur Isolierung glialer Subpopulationen. Der Zweck des Verfahrens besteht darin, Mikroglia, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) und Astrozyten aus kortikalem, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksgewebe zu dissoziieren, um weitere In-vitro-Analysen zu ermöglichen. Die ZNS-Region-Isolierungsverfahren ermöglichen die Bestimmung der regionalen Heterogenität zwischen Gliazellen in mehreren Zellkultursystemen. Es wird eine schnelle Isolierung der ZNS-Region durchgeführt, gefolgt von der mechanischen Entfernung von Hirnhäuten, um eine Meningealzellkontamination der Gliazellen zu verhindern. Dieses Protokoll kombiniert sanfte Gewebedissoziation und Beschichtung auf einer spezifizierten Matrix, die entwickelt wurde, um die Zellintegrität und -adhärenz zu erhalten. Die Isolierung gemischter Glia aus mehreren ZNS-Regionen bietet eine umfassende Analyse potenziell heterogener Gliazellen bei gleichzeitiger Maximierung der Verwendung einzelner Versuchstiere. Darüber hinaus werden gemischte Glia nach der Dissoziation von regionalem Gewebe weiter in mehrere Zelltypen unterteilt, darunter Mikroglia, OPCs und Astrozyten zur Verwendung in Einzelzelltypen, Zellkulturplatteneinsätzen oder Kokultursystemen. Insgesamt bieten die demonstrierten Techniken ein umfassendes Protokoll von breiter Anwendbarkeit für die sorgfältige Dissektion von vier einzelnen ZNS-Regionen von murinen Neugeborenen und umfassen Methoden zur Isolierung von drei einzelnen Gliazelltypen zur Untersuchung der regionalen Heterogenität in einer beliebigen Anzahl von In-vitro-Zellkultursystemen oder Assays.

Die unten gezeigten repräsentativen Daten zeigen, dass die IFNγ-Signalisierung die OPC-Differenzierung und -Reifung beeinflusst. Ohne das Vorhandensein des IFNγ-Rezeptors (IFNγR) differenzieren kortikale OPCs nicht so leicht in reife myelinisierende Oligodendrozyten, was durch das Fehlen einer MBP-Färbung belegt wird (Abbildung 1). Da Oligodendrozyten und Astrozyten von einem gemeinsamen Vorläufer abgeleitet sind, analysierten wir die GFAP-Expression, die Astrozyten kennzeichnet. Wir fanden heraus, dass IFNγR-defiziente Zellen GFAP stark exprimieren, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise einen astrozytären Phänotyp annehmen, was frühere Berichte bestätigt19.
Zusätzliche Hinweise auf regionale Heterogenität in ZNS-Zellen werden durch eine variierende Astrozytenmorphologie belegt, wie sie in Astrozyten aus Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark beobachtet wird (Abbildung 2). Bemerkenswert ist, dass Astrozyten aus derselben Region auch morphologische Heterogenität aufweisen können, was die Annahme unterstützt, dass dieser Gliasubtyp hochdynamisch ist. Die Unterschiede in der Zellarchitektur deuten auf funktionelle Vielfalt hin, und daher ist die Fähigkeit, Gliapopulationen zu isolieren, notwendig, um phänotypische Reaktionen in Abwesenheit und Anwesenheit von Mikroumweltreizen zu untersuchen.
Oligodendrozyten sind entscheidend für die Myelinisierung neuronaler Axone und sind für die richtige ZNS-Reparatur und -Funktion notwendig. OPCs führen zu ihren ausgereiften Gegenstücken, weshalb es wichtig ist, die Biologie hinter ihrer Differenzierungsfähigkeit zu verstehen. Die Zytokinsignalisierung beeinflusst maßgeblich das Verhalten von Stamm- und Immunzellen. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie regionale Reaktionen von OPCs auf die differentielle Zytokinstimulation variieren können (Abbildung 3), was sich auf ihre Fähigkeit auswirken kann, sich in reife myelinisierende Oligodendrozyten zu differenzieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Daten zur OPC-Differenzierung bei WT- und IFNγR-/- Mäusen in Gegenwart von exogenem IFNγ. Kortikale OPCs wurden aus ( A ) WT und (B) IFNγR-/- P4 Mauswelpen nach dem oben beschriebenen Verfahren isoliert. Die Zellen wurden 48 h lang mit 1 ng/ml IFNγ behandelt, dann fixiert und gefärbt, um die Zelldifferenzierung abzugrenzen. OPCs wurden für NG2 und GFAP markiert, um diejenigen zu identifizieren, die einen astrozytären Phänotyp annahmen. Ebenso wurden OPCs auch für NG2 und MBP markiert, um diejenigen zu identifizieren, die sich in reife Oligodendrozyten differenzierten. Maßstabsbalken = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Daten zur regionalen Heterogenität der Astrozytenmorphologie. Astrozyten aus Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark wurden aus P4-Mauswelpen unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls isoliert und durch Immunzytochemie nach 48 h in Kultur für GFAP (grün) markiert. Maßstabsbalken = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Daten, die differentielle Reaktionen regionaler OPCs auf Zytokine zeigen. OPCs wurden aus dem Hirnstamm und Rückenmark von P4-Mauswelpen unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls isoliert. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen (1-10 ng/ml) von (A) IFNγ oder (B) Interleukin (IL)-17 behandelt, um den differentiellen Einfluss von Zytokinen auf die Fähigkeit regionaler OPCs zur Differenzierung in myelinisierende Oligodendrozyten zu untersuchen. Nach einer 48-stündigen Inkubation mit spezifizierten Zytokinen wurden OPCs fixiert und für NG2 (grün) und MBP (rot) markiert. Maßstabsbalken = 20 μM. Daten stellen Mittel ± SEM dar. **, p < 0,01; , S. < 0,001; , p < 0,0001 durch 2-Wege-ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/Antibiotikalösung (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1,0 ml</td>
			<td colspan="2">100X Antibiotikum/Antimykotikum mit 10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 mg/ml Streptomycin</td>
		</tr><tr><td>25 mg/ml</td>
			<td colspan="2">Amphotericin B</td>
		</tr><tr><td>99 ml</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Gemischte Glia-Medien (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 ml</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (hohe Glukose, w/L-Glutamin, w/Na-Pyruvat)</td>
		</tr><tr><td>10 ml</td>
			<td colspan="2">Wärmeinaktiviertes FBS</td>
		</tr><tr><td>1,0 ml</td>
			<td colspan="2">L-Glutamin (100X)</td>
		</tr><tr><td>1,0 ml</td>
			<td colspan="2">Antibiotikum/Antimykotikum</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPC-Medien (50 ml)</td>
		</tr><tr><td>49 ml</td>
			<td colspan="2">Neurobasale Medien</td>
		</tr><tr><td>1,0 ml</td>
			<td colspan="2">B27 Ergänzung (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">HINWEIS: PDGF-AA wird vor jedem Medienwechsel neu hinzugefügt.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Astrozyten-Medien (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 ml</td>
			<td colspan="2">MEM mit glutaminhaltigen Earle-Salzen</td>
		</tr><tr><td>36 ml</td>
			<td colspan="2">Glukose (verwenden Sie 100 mg / ml Brühe für die Endkonzentration von 20 mM)</td>
		</tr><tr><td>100 ml</td>
			<td colspan="2">Wärmeinaktiviertes FBS</td>
		</tr><tr><td>100 ml</td>
			<td colspan="2">Hitzeinaktiviertes Pferdeserum</td>
		</tr><tr><td>10 ml</td>
			<td colspan="2">Glutamin (verwenden Sie 200 mM Vorrat, wenn nicht im Lagermedium enthalten)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPTIONAL: 10 ng/ml rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor der Maus</td>
		</tr><tr><td colspan="3">HINWEIS: Alle Medien steril filtern und bei 4 °C lagern, bis sie verwendet werden.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Puffer- und Medienrezepte.

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Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

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Research

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Neuroscience

3.2K Aufrufe.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Serie: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Biologie

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolierung von Mikroglia aus der Hirnrinde eines adulten Mausgehirns

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...

Immunology

Immune Systems and Components

Cell Isolation and Culture

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

Source: Zhang, H. et al. <a href="https://app.jove.com/v/63511">Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolierung von Mikroglia aus demyelinisierenden Läsionen des Mausgehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

 All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Materials

	&#160;Prepare ...

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

Source: Sarkar, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55364">Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Growing of Mixed Glial ...