Dieses Protokoll verwendet intrazelluläre Aufnahmen von Spinal-Motoneuronen, um den Einfluss der transspinalen Gleichstromstimulation direkt auf die Funktion von Spinalnetzwerken zu untersuchen. Der große Vorteil dieser Technik ist, dass es intrazelluläre Aufnahmen auf vollausgereiften Nervensystem durchgeführt werden ermöglicht. Erleichterung der Übersetzung der experimentellen Beobachtungen in praktische Anwendungen.
Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Pedalreflex, eine betäubte sechs Monate alte männliche Wistar Ratte, verwenden Sie ein Sezieren Mikroskop und eine Nummer 21 Klinge, um einen Längshautschnitt vom Brustbein bis zum Kinn zu machen. Und verwenden Sie stumpfe Sezierung, um die rechte Jugularvene zu entlarven. Platzieren Sie zwei, 4-0 Ligaturen unter dem Abschnitt der Vene ohne Verzweigungspunkte.
Und machen Sie einen lockeren Knoten am proximalen Ende des Venensegments. Und ein lockerer Knoten am distalen Ende des Segments. Klemmen Sie die Vene proximal an das Herz, und ligate das distale Ende der Vene.
Verwenden Sie eine Irisschere, um einen Schnitt zwischen der Klemme und der Distalligatur zu machen. Und, mit einer Klappe der Vene, führen Sie einen vorgefüllten Katheter an die Stelle, wo die Vene durch die Klemme blockiert wird. Entfernen Sie dann die Klemme und drücken Sie den Katheter mehrere Millimeter in die Vene.
Für eine Trachealrohrplatzierung verwenden Sie stumpfe Zangen, um die beiden Unterkieferdrüsen zu trennen, die die Sternohyoid-Muskeln bedecken. Und trennen Sie die sternohyoid Muskeln an der Mittellinie, um die Luftröhre zu entblößen. Platzieren Sie drei, 4-0 Ligaturen unter der Luftröhre, und machen Sie zwei Knoten unter der Einfügemarke des Luftröhrenrohrs und einen Knoten darüber.
Dann ein Luftröhrenrohr in die Luftröhre unterhalb des dritten Trachealknorpels einlegen. Und sichern Sie die Röhre an Ort und Stelle mit den vorbereiteten Ligaturen. Um die Hintergliedernerven zu sezieren, verwenden Sie eine Klinge der Linie 21, um einen Längsschnitt auf der hinteren Seite der linken Hintergliedmaße, von der Achillessehne bis zur Hüfte, zu machen.
Und verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt zwischen den vorderen und hinteren Bereichen der poplitealen Fossa, auf der Rückseite des Kniegelenks zu machen. Schneiden Sie zwei Köpfe des Bizeps femoris, um den Ischiasnerv zu belichten. Und trennen Sie den seitlichen Kopf vom medialen Kopf des Magen-Darm-Muskels, um den Tibianerv und seine Zweige zu belichten.
Dann verwenden Sie Nummer 55 Zangen, um sorgfältig den medialen Gastrocnemius und die seitlichen Gastrocnemius und Soleus Nerven zu sezieren. Trennen Sie sie von den umgebenden Geweben, während ihre Verbindung zu den jeweiligen Muskeln. Um die Laminektomie durchzuführen, verwenden Sie eine Klinge der Linie 21, um einen Längsschnitt vom Kreuzbein bis zum Brustwirbel zu machen.
Und identifizieren Sie den Th13-Wirbel als unterstes Brustsegment mit rippeneinführender. Verwenden Sie dann feine Rongeur, um die spinalen Prozesse und Laminae von der Th13 bis zu den L2-Wirbeln zu entfernen, um die Lendensegmente des Rückenmarks freizulegen. Um die Wirbelsäule zu fixieren, legen Sie die Ratte in einen maßgeschneiderten Rahmen auf einem 37 Grad Celsius Heizkissen, das mit einem geschlossenen Heizsystem verbunden ist.
Und verwenden Sie die Hautklappen, um einen tiefen Pool über dem freiliegenden Rückenmark zu bilden. Legen Sie Metallklemmen unter die Th12-Querprozesse und bei den L3-Spinnprozessen und füllen Sie den Pool mit 37 Grad Mineralöl. Verwenden Sie die Hautklappen, um einen tiefen Pool von Mineralöl über die exponierten tibialen, medialen Gastrocnemius und seitlichen Gastrocnemius und Soleus Nerven zu machen.
Und legen Sie die Nerven auf bipolare Silberdraht stimulierende Elektroden. Dann verbinden Sie die Elektroden mit einem quadratischen Pulsstimulator über separate Stimulationskanäle für jeden Nerv. Für eine Oberflächenelektrodenplatzierung unter dem Sezieren des Mikroskops legen Sie eine Silberkugelelektrode auf die linke Kaudalseite des freiliegenden Rückenmarks.
Mit einer Referenzelektrode in die Rückenmuskulatur eingesetzt. Und verbinden Sie beide Elektroden mit dem Differenz-DC-Verstärker. Verwenden Sie einen konstanten Stromstimulator, um den medialen Gastrocnemius und die lateralen Gastrocnemius- und Soleusnerven zu stimulieren, wobei quadratische Impulse von 0,1 Millisekunden Dauer bei einer Dreihertz-Frequenz wiederholt werden und die affegenden Volleys beobachtet werden.
Am Ende der Simulation bewegen Sie die Oberflächenelektrode rostral, und wiederholen Sie die Stimulation, um die Wirbelsäulensegmente zu identifizieren, bei denen die Amplituden der Volleys für jeden Nerv am höchsten sind. Nach der Bestimmung der Position des maximalen Volley, liefern Sie einen neuromuskulären Blocker intravenös, um die Ratte zu lähmen. Während ein Assistent das Trachealrohr mit einem externen Ventilator in Übereinstimmung mit einem Nagetier-kompatiblen Kappennominator verbindet.
Um die Dura und Pia mater zu öffnen, verwenden Sie die Nummer 55 Zangen, um die Dura mater sanft zu heben, und schneiden Sie das Gewebe kauarisch aus dem L5-Segment, rostral bis zum L4-Segment. Verwenden Sie dann ein Paar ultradünne 5SF Zangen, um ein kleines Pflaster in der Pia zu machen, das die dorsale Säule zwischen den Blutgefäßen bedeckt. Genau auf höhe des maximalen affegenden Volleys aus dem medialen Gastrocnemius und dem lateralen Gastrocnemius und Soleusnerv.
Um die transspinalen Gleichstromstimulationselektroden zu platzieren, legen Sie einen salzgetränkten Schwamm auf die Rückenseite der Th12-Wirbel. Und verwenden Sie feine Manipulation, um den Schwamm mit einer aktiven transspinalen Gleichstromstimulationselektrode zu drücken. Montieren Sie dann eine benutzerdefinierte gepoolte Mikroelektrode auf den Mikromanipulator, so dass eine Ein- bis zwei Mikrometer-Schrittbewegung und stereotaxic-Kalibrierung.
Und fahren Sie eine Mikropipette-Spitze in ein ausgewähltes Pflaster in der Pia, in einem 15 bis 20 Grad medialen Seitenwinkel. Um die Motoneuronmembran und die Brenneigenschaften im Brückenmodus des intrazellulären Verstärkers aufzuzeichnen, stimulieren Sie die jeweiligen Nervenzweige, um das Motoneuron auf der Grundlage des alles oder nichts Auftretens des antidromischen Wirkungspotentials zu identifizieren. Im diskontinuierlichen Stromklemmenmodus des intrazellulären Verstärkers mit stromaktuellem Schaltratenmodus vier bis acht Kilohertz verwenden Sie einen intrazellulären Depolarisationsimpuls von 0,5 Millisekunden, um ein kieferorthopädisches Wirkungspotenzial im Motoneuron zu evozieren.
Um den Zelleingangswiderstand zu berechnen, stimulieren Sie ein Motoneuron mit 40 kurzen 100 Millisekunden-Impulsen, die einen Nanogrammstrom hyperpolarisieren. Um den realen Basiswert als minimale Amplitude des depolarisierenden Stroms zu bestimmen, der erforderlich ist, um eine einzelne Spitze auszulösen, stimulieren Sie ein Motoneuron mit 50 Millisekunden-Quadratwellenimpulsen bei steigenden Amplituden. Dann injizieren 500 Millisekunden quadratische Wellenimpulse des depolarisierenden Stroms, bei zunehmenden Amplituden.
In 0,1 bis zwei Nano-Amp-Schritten, um rhythmische Entladungen von Motoneuronen zu evozieren. Für eine transspinale Gleichstromstimulation beginnen Sie die Polarisationsverfahren durch transspinale Anwendung von Gleichstrom, während eine stabile Penetration des Motoneurons erhalten bleibt. Hier wird ein typisches orthotropes Aktionspotential gezeigt, das durch intrazelluläre Stimulation evoziert wird, das alle Kriterien für die Dateneinschlusse erfüllt.
In dieser Analyse, eine Zellreaktion auf einen 100 Millisekunden hyperpolarisierenden Stromimpuls von einem Nanogramm. Von dem aus sowohl der Peak- als auch der Plateau-Eingangswiderstand eines Motoneurons aus der Spannungsablenkung bestimmt werden können, kann man beobachten. Diese erweiterte Spannungsspur einer echten Grundspitze weist eine deutlich ausgeprägte Spannungsschwelle der Spitze auf.
Angabe des Grads der Membrandepolarisation, bei dem spannungsverzierbare Natriumkanäle aktiviert werden, um das Aktionspotential zu initiieren. Diese Diagramme liefern Beispiele für intrazelluläre Spannungsspuren. Von zwei Motoneuronen, intrazellulär mit 500 Millisekunden quadratischen Impulsen des depolarisierenden Stroms stimuliert.
Vor, während und nach einer transspinalen Gleichstromstimulation. Es wurde festgestellt, dass die anodale transspinale Gleichstromstimulation in Richtung einer erhöhten Motoneuronerität und höherer Frequenzen des rhythmischen Brennens wirkt. Während die kathhodale transspinale Gleichstromstimulation auf Diefeuerhemmung wirkte.
Darüber hinaus überdauerten die Auswirkungen beider Arten der transspinalen Gleichstromstimulation die Polarisationsphase. Ungenaue Daten können erfasst werden, wenn die Dateneinschlusskriterien durch unvollkommene Zelldurchdringung gefährdet sind. Ein Versäumnis, den Mikroelektrodenwiderstand und die Kapazität oder eine Rückenmarksinstabilität zu kompensieren.
Es ist zwingend erforderlich, dass das Rückenmark während der Zerlegung nicht beschädigt wird, da Verletzungen zu einem Wirbelsäulenschock führen können, was weitere Aufnahmen unmöglich macht. Es ist möglich, Gewebeproben für weitere histologische oder immunzytochemische Analysen zu ernten. Beispielsweise kann die Messung der c-fos-Expression als Proxy der neuronalen Aktivität verwendet werden.
