Diese Arbeit wurde möglich dank der finanziellen Unterstützung der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM), der Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship für ALS Forschung (ALS Association), NIH NINDS Grants NS05462 und NS034382 und ANR Stipendium HyperMND gemacht.

Ein. Step One Pre-Anästhesie Medikamente: 10-15 min vor der Einleitung der Narkose, injizieren Atropin (0,20 mg / kg) und methylprenidsolone (0,05 mg) subkutan den Speichelfluss und Ödeme bzw. zu verhindern. 2. Schritt Zwei Narkoseeinleitung: injizieren Pentobarbital-Natrium (70 mg / kg) oder ein Gemisch von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg und 10 mg / kg) intraperitoneal. Lassen Sie die Maus unter, bis keine toe Prise reflex erhalten werden können gehen. Wenn der Anästhesie scheint zu hell, mit 1/4 der Dosis ergänzen. 3. Schritt Drei * Hinweis: Diese Operation ist ein Terminal Verfahren. Wenn ein chirurgischer Ebene der Anästhesie erreicht wurde, übertragen Sie die Maus auf einer erhöhten warme Decke in Bauchlage. <ol><li> Decken die Schnauze des Maus mit einer Maske liefert reines O 2 mit einer Strömungsgeschwindigkeit etwa 100 ml / min. </li><li&gt; Mit einem Haarschneider, rasieren die dorsale Region aus dem Nacken an der Basis des Schwanzes. </li><li> Rasur auch das Recht Hinterlauf. </li><li> Flip Maus Rückenlage, aber darauf achten, dass die Sauerstoffmaske an ihrem Platz bleiben. </li></ol> 4. Schritt Vier Sichern Sie die Maus anstelle mit Nähten rund um die Glieder geschlungen und gesichert an den vier Ecken der Arbeitsfläche. 5. Schritt Fünf Legen Sie einen Temperaturfühler, um die Maus Kerntemperatur überwachen. Passen Heizdecke / Lampenleistung auf Kerntemperatur zwischen 36 ° C und 38 ° C zu halten 6. Tracheotomie und Beatmung <ol><li> Mit stumpfen Schere, einen Schnitt über die Luftröhre und ziehen die Haut weg auf beiden Seiten. </li><li> Mit stumpfen Pinzette, zerreißen die Speicheldrüsen, um so zwei dünnen Muskeln (M. sternohyoideus), die die Luftröhre aussetzen. </li><li> Mit stumpfen Pinzette, trennen die beiden muscles entlang ihrer medialen Trennung der Luftröhre zu offenbaren. </li><li> Mit Hilfe eines Dumont 7 Pinzette, schieben zwei Längen von 4,0 Seidennaht unter der Luftröhre. </li><li> Machen Sie eine transversale Schnitt in die Luftröhre zwischen zwei Knorpelringe aber darauf achten, nicht völlig Abschnitt der Luftröhre. </li><li> Legen Sie die Trachealtubus sich die Luftröhre, dann sichern Sie sie auf beiden Seiten der Einführöffnung durch Anbinden die Nähte über sie. Der Trachealtubus mit einer Maus Ventilator (SAR-830/AP, CWE Inc.) und einer Capnograph (μcapstar, CWE Inc.) verbunden. Das Beatmungsgerät angeschlossen ist, durch einen Compliance-Beutel, mit einer Quelle aus reinem O 2. Passen Sie die Parameter des Ventilators (Atemfrequenz 100-150 bpm, end-Tidalvolumen 170-310 ul), so dass die Maus nicht im Kampf gegen die künstliche Beatmung und die endexspiratorischen pCO 2 ist zwischen 4 und 5% stabil. </li></ol> 7. Platzierung der intravenösen <ol><li> Mit stumpf Techniken, aussetzen VenaAder auf einer Seite des Halses. Auf dieser Stufe teilt sich der Jugularvene in zwei große Stämme, die vordere und hintere Gesichtsvenen. </li><li> Führen Sie die folgenden Schritte zweimal, ein Set für jedes dieser Stämme: <ol><li> Mit Dumont 4 oder 5 Zangen, trennen Sie sorgfältig die Vene aus den umliegenden Bindegewebes. </li><li> Mit Dumont 7 Pinzette, schieben zwei Längen von 6,0 Seidennähte unter der Vene. trennen sie so weit wie möglich entlang der Länge der Vene. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Behälter Clip auf der proximalen Seite der Vene (die Seite, die das Herz), und binden Sie die distale Seite der Vene. </li><li> Mit sehr feinen Iris Schere, einen kleinen Querschnitt im Vene, unter größter Sorgfalt nicht Abschnitt der Vene komplett. </li><li> Einfügen eines vorgefüllten 1Fr Katheter (premicath, Vygon) in der Öffnung, bis das Gefäß-Clip. </li><li> Halten Sie die Vene und den Katheter zusammen in einem Dumont 4 Pinzette vorsichtig entfernen das Schiff Clip, und drücken Sie dann den Katheter ein paar more Millimeter in die Vene. </li><li> Befestigen des Katheters durch das Binden mit beiden Nähte auf beiden Seiten der Insertion. </li></ol></li><li> Einer der Katheter an eine Spritze oder eine Spritzenpumpe mit ergänzenden Dosen von Anästhetika Bedarfsfall (normalerweise alle 10-30 min). Injizieren Der IV beträgt entweder 6 mg / kg Pentobarbital-Natrium oder 1250 40 ug / kg / min von Ketamin / Xylazin 12. Der andere Katheter wird an einer Spritzenpumpe für eine langsame intravenöse Infusion (50 ul / h) einer 4% Glucose enthaltenden Lösung NaHCO 3 (1%) und plasmion (14%) verbunden. </li></ol> 8. Schließen Sie die Haut des Halses mit Nadel und Faden, und gibt die Maus Bauchlage 9. Dissektion der Hind-Schenkel Muskeln und Nerven <ol><li> Mit Schere, einen Einschnitt von der Spitze des Oberschenkels der Achillessehne. Trennen Sie die Haut von den darunter liegenden Muskeln, kümmert sich nicht um die Blutgefäße schädigen. Kauterisieren nach Bedarf. </li><li&gt; Identifizieren Sie die vordere Kante des Biceps femoris, die als weiße Linie liefen den Oberschenkel erscheint. Mit einer Schere vorsichtig entlang der Linie öffnen vom Knie bis hin zu den Hüftknochen. Trennen Sie die Muskeln. Der Ischiasnerv ist nun sichtbar unter dem Biceps femoris. </li><li> Sorgfältig sezieren die Biceps femoris. Cauterize / Ligatur wie notwendig, um Blutungen zu verhindern. Der Biceps femoris kann vollständig entfernt werden oder einfach zurückgelehnt, um den Ischiasnerv und die Triceps surae Muskeln freizulegen. </li><li> Sezieren das Sural Nerv. </li><li> Mit 8/0 Seidenfaden, binden den distalen Teil des Nervus peroneus communis und schneiden distal der Knoten. Sezieren die Nerven den ganzen Weg bis, so nah an der Hüfte wie möglich. </li><li> Identifizieren Sie die N. tibialis zwischen den peroneus communis und Sural Nerven. Unter den verschiedenen Zweigen des N. tibialis, identifizieren die Zweige innervieren den M. triceps surae von den Zweigen, die tiefer (im Folgenden als N. tibialis genannt) gehen. </li><li> Mit 8/0 SeideGewinde, zusammen binden alle Zweige des Nervus tibialis, während intakt zu halten die Zweige innervieren den M. triceps surae. Schneiden Sie den Nervus tibialis distal der Knoten und sezieren den Nerv so weit wie möglich. </li><li> Decken das gesamte Hinterlauf mit einem Gaze mit Kochsalzlösung getränkt, um Austrocknung zu verhindern, während Sie mit dem nächsten Schritt. </li></ol> 10. Laminektomie <ol><li> Mit Schere, einen Einschnitt entlang des Rückgrats. Trennen Sie die Haut von den darunter liegenden Muskeln. </li><li> Make zwei Einschnitte auf jeder Seite der Wirbel um die subkutane Muskulatur trennen. Dann schneiden sich Sehne der Muskeln, die auf der Seite der Wirbelsäule auf jeder Seite anschließen. </li><li> Mit stumpfen Pinzette und einer feinen Kürette, entfernen Sie den Rest des Muskels auf der Rückenseite der Wirbel um die Dornfortsätze eindeutig zu identifizieren jeden einzelnen Wirbel. </li><li> Identifizieren Wirbeln T13 und L1. T13 ist der letzte Wirbel zu haben Rippen befestigt. Die Wirbelsäule will immobilisiert mit den Cunningham Spinal Cord Wirbelkörper Klemmen (Stoelting Co.) werden. Zeigen die spinalen Klammern auf jeder Seite des T13 und L1. Achten Sie darauf, das Rückenmark komprimieren, sondern setzen ein wenig Spannung in der Längsachse. Überprüfen Sie, dass die Wirbelsäule auch durch Drücken sanft mit einer Pinzette gesichert. </li><li> Mit feinen rongeurs, entfernen Sie die Dornfortsätze dann die Lamellen über T13 und L1, wodurch die Wirbelsäule. </li><li> Bedecken Sie den exponierten Rückenmarks mit kleinen Stückchen aus Baumwolle oder spongel mit Kochsalzlösung getränkt, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Legen Sie eine maßgeschneiderte Kunststoff-Bad auf der Rückseite, um das Rückenmark. Sichern Sie das Bad im Ort mit 4/0 seidenen Faden. Stellen Sie sicher, dass das Bad wasserdicht durch Versiegelung mit Kwik-Cast Dichtmittel (WPI) ist. </li><li> Sobald der Kwik-Cast getrocknet ist, entfernen Sie die Watte bedeckt das Rückenmark, und füllen Sie die Badewanne mit Mineralöl. </li><li> Mit Dumont 5 Zangen und sehr feine Iris Schere, sanft auf der Dura Kumpel ziehenr um ​​das Rückenmark, und öffnen Sie sie so weit wie möglich in beiden Richtungen. Falten Sie die Dura auf jeder Seite des Rückenmarks. </li><li> Senken der erhöhten Plattform, auf der die Maus liegend so zusammengestellt ist, damit es durch den Wirbelkörper Klammer suspendiert. </li><li> Verwenden Sie eine andere Wirbelsäule Klammer um einen Dornfortsatz des Sakralbereich den Rücken des Tieres unterstützt spannen. </li><li> Eine dritte Klemme verwendet wird, um das Recht Hinterbein und Knöchel immobilisieren, gebogen in einem 90 ° Winkel am Knie. </li></ol> 11. Achillessehne Dissection <ol><li> Mit der Schenkel um 90 ° gebogenen am Knie und am Sprunggelenk, entfernen Sie die Gaze für den Hinterlauf Bereich und sezieren die Achillessehne frei von umgebenden Gewebe. Dissect so viel wie möglich der Triceps surae vom umgebenden Gewebe als gut. </li><li> Schneiden Sie die Sehne des plantaris Muskel in der Nähe der Kalkaneus, dann schneiden Sie es erneut, um die Sehne vollständig zu entfernen. </li><li> Mit einem Gewinde Nadel legen 6/0 Seidenfaden durch the Achillessehne und machen eine dreifache Knoten um die Sehne. </li><li> Legen Sie die Kraftaufnehmer in der Nähe der knoten, schneiden den distalen Teil der Sehne und befestigen Sie es an den Kraftaufnehmer mit dem seidenen Faden. </li><li> Legen Sie zwei Längen von Draht aus nichtrostendem Stahl unter der Faszie des Triceps surae Muskeln. Diese Drähte werden auf einer extrazellulären AC Verstärker für EMG-Aufzeichnung verbunden. </li><li> Setzen Sie den Nervus peroneus communis und N. tibialis auf zwei bipolare Haken Elektroden. </li><li> Setzen Sie den Triceps surae Nerven an der Kathode eines Hakens Elektrode, die Anode berühren einen nahe gelegenen Muskeln. </li><li> Schließen Sie alle stimulierenden Elektroden zu einer Isolierstation. </li><li> Platzieren einer Kugel Elektrode auf der dorsalen Fläche des Rückenmarks, mit einer extrazellulären Wechselstromverstärker zur Schnur Dorsum Potentiale aufzuzeichnen. Legen Sie eine Ag / AgCl-Referenzelektrode in Kontakt mit einem Rückenmuskulatur. </li></ol> 12. Schritt Zwölf Stimulieren des Triceps surae NervenVerwendung einer 50 usec Rechteckimpuls zunehmender Intensität bei einer niedrigen Frequenz (&lt;1 Hz), bis die maximale Amplitude twitch beobachtet wird. Bewegen Sie den Kraftaufnehmer den Muskel zu dehnen, während die Überwachung der Amplitude des Zuckungsantwort bis das Zucken Amplitude ein Maximum erreicht. 13. Intrazelluläre Aufnahmen von Motoneuronen Von diesem Zeitpunkt an werden Standard elektrophysiologischen Techniken verwendet werden, um eine intrazelluläre Elektrode herzustellen, dringen ein Neuron im Rückenmark und identifizieren es als ein Motoneuron. <ol><li> Ziehen Sie einen Glasmikropipette zu einer ~ 1 um tip mit einer Pipette Puller (P-97 Feinpipettenziehvorrichtung, Sutter Instruments). Füllen Sie die Elektrode mit einem KCl 3M-Lösung (Widerstand der Elektrode 10-20 MOhm). </li><li> Mit einem Mikropositionierer, fahren die Mikropipette, verbunden mit einem intrazellulären Verstärker (Axoclamp 2B, Axon Instruments) in das Rückenmark. Überwachen Sie die lokalen Feldpotentiale hervorgerufen durch die Stimulation von each Nerven, um die Fahrbereitschaft des Triceps surae zu lokalisieren. </li><li> Vorsichtig nähern putativen Motoneuronen während der Überwachung des Widerstandes der Mikroelektrode. Beim Schieben gegen eine Membran, steigt der Widerstand. Penetration kann irgendwann mit der &quot;Buzz&quot;-Funktion des intrazellulären Verstärker erleichtert werden. </li></ol> 14. Euthanasie Procedure Am Ende des Versuchs wird das Tier durch eine Überdosis Pentobarbital (210 mg / kg IV), gefolgt durch Enthauptung getötet.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Herstellung hier beschrieben ist das erste, das erlaubt, in der erwachsenen Maus, simultane Aufzeichnung eines intrazellulären lumbalen Motoneuron und die Messung der Kraft, die durch den Muskelfasern durch seine Axon innerviert hergestellt. Aufgrund der kleinen Größe des Tieres können die chirurgischen Fähigkeiten für diese Zubereitung zu schwierig zu erwerben. Sobald jedoch diese Fähigkeiten beherrscht werden, kann die gesamte Operation in drei Stunden durchgeführt werden, und ...

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Marin Manuel 
 
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Manuel Marin

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Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Atropinsulfat </td><td> Aguettant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methylprenidsolone </td><td> Pfizer </td><td> Solu-Medrol </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpentobarbiton </td><td> Sanofi-Aventis </td><td> Pentobarbital </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plasma-Expander </td><td> Roger Bellon </td><td> Plasmagel </td><td></td></tr><tr><td> Blunt Scheren </td><td> FST </td><td> 14079-10 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt feinen Schere </td><td> FST </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Federschere </td><td> FST </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Feinen Pinzette gezahnt </td><td> FST </td><td> 11370-32 </td><td></td></tr><tr><td> Feinen Pinzette gezahnt </td><td> FST </td><td> 11370-31 </td><td></td></tr><tr><td> Cunningham Spinal Adapter </td><td> Stoelting Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kwik-Cast Dichtstoff </td><td> WPI </td><td> # KWIK-CAST </td><td></td></tr><tr><td> Ventilator </td><td> CWE Inc </td><td> SAR-830/AP </td><td></td></tr><tr><td> Kapnograph </td><td> CWE Inc </td><td> μcapstar </td><td></td></tr><tr><td> Heizdecke </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 507221F </td><td></td></tr><tr><td> Intrazelluläre Verstärker </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoclamp 2B </td><td></td></tr><tr><td> Pipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333-500G </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo

Das Rückenmark Motoneuron ist seit langem ein gutes Modell für die Untersuchung neuronaler Funktion, weil es ein Neuron des zentralen Nervensystems mit den einzigartigen Eigenschaften von (1) mit leicht identifizierbaren Ziele (die Muskelfasern) und daher eine sehr bekannte Funktion ist (die Muskelkontraktion steuern), (2) dass die konvergente Ziel vieler Wirbelsäulen-und absteigend Netzwerke, daher der Name &quot;gemeinsame Endstrecke&quot; und (3) mit einem großen soma, die es möglich, sie mit scharfen intrazellulären Elektroden eindringen lässt . Weiterhin, wenn es in vivo untersucht, ist es möglich, gleichzeitig aufnehmen die elektrische Aktivität der Motoneuronen und der Kraft, die durch ihre Muskelkraft Ziele entwickelt. Durchführen intrazelluläre Ableitungen von Motoneuronen in vivo daher legte den Experimentator in der einzigartigen Position, in der Lage zu studieren, zur gleichen Zeit, all die Fächer des &quot;Motor-Einheit&quot; (der Name des Motoneuron, dessen Axon unddie Muskelfasern es innerviert 1): Die Eingänge Auftreffen auf die Motoneuronen, die elektrophysiologischen Eigenschaften der Motoneuronen, und die Auswirkungen dieser Eigenschaften auf die physiologische Funktion der Motoneuronen, also die Kraft, durch die Motor-Einheit produziert. Allerdings ist dieser Ansatz sehr schwierig, da die Zubereitung nicht sein kann gelähmten und damit die mechanische Stabilität für die intrazelluläre Aufnahme reduziert wird. So hat diese Art von Experimenten nur bei Katzen und Ratten erzielt worden. Jedoch könnte die Untersuchung der Wirbelsäule motorische Systeme stellen eine enorme Sprung wenn es möglich war, ähnliche Experimente in normalen und genetisch modifizierten Mäusen durchzuführen. Aus technischen Gründen, die Untersuchung der Wirbelsäule Netzwerke in Mäusen meist hat für Neugeborene in vitro Präparaten, wo die Motoneuronen und die Wirbelsäule Netzwerke sind unreife beschränkt, werden die Motoneuronen von ihren Zielen getrennt, und wenn sie in Scheiben, die mo studierttoneurons werden von den meisten ihrer Eingänge getrennt. Bis vor kurzem waren nur ein paar Gruppen gelang es, intrazelluläre Ableitungen von Motoneuronen in vivo 2-4 durchzuführen, einschließlich unserem Team, ein neues Präparat, das uns zu einer sehr stabilen Aufnahmen von Motoneuronen in vivo zu erhalten, in erwachsenen Mäusen 5,6 erlaubt veröffentlicht. Allerdings wurden diese Aufnahmen in gelähmten Tieren, dh ohne die Möglichkeit, die Kraft Ausgang dieser Motoneurone aufzunehmen. Hier präsentieren wir eine Erweiterung dieser ursprünglichen Zubereitung, in denen wir waren in der Lage, um die gleichzeitige Aufnahmen der elektrophysiologischen Eigenschaften der Motoneurone und der Kraft, die durch ihre motorischen Einheit entwickelt zu erhalten. Dies ist eine wichtige Errungenschaft, da es uns um die verschiedenen Arten von Motoneuronen auf der Grundlage ihrer Kraft Profil zu identifizieren und damit Offenlegung ihrer Funktion ermöglicht. Gekoppelt mit genetischen Modellen stören Wirbelsäule segmentale Schaltung 7-9 oder Reproduktions menschlichen disease 10,11 rechnen wir diese Technik ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der spinalen motorischen Systems.

Abbildung 1 zeigt, wie ein Motoneuron aus dem Triceps surae Gruppe nach dem Eindringen zu identifizieren. Bei niedrigen Stimulationsintensität, kann nur ein monosynaptischen EPSP (Abbildung 1A). Bei höheren Intensität könnte der EPSP groß genug sein, um eine &quot;orthodromen&quot; spike (1B) auszulösen. Bei noch höheren Stimulationsintensität, erscheint eine Alles-oder-Nichts-antidrome Spitze, mit einer kürzeren Latenzzeit als die monosynaptischen EPSP <strong...

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Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

Dieses neue Verfahren erlaubt die gleichzeitige intrazelluläre Aufnahme eines einzigen erwachsenen Maus Motoneuron und die Messung der Kraft, die von seiner Muskelfasern hergestellt. Die kombinierte Untersuchung der elektrischen und mechanischen Eigenschaften der Motoreinheiten in normalen und genetisch modifizierten Tieren ist ein Durchbruch für das Studium des neuromuskulären Systems.

Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

simultaneous-intracellular-recording-lumbar-motoneuron-force-produced

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

14.6K Aufrufe.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Dieses neue Verfahren erlaubt die gleichzeitige intrazelluläre Aufnahme eines einzigen erwachsenen Maus Motoneuron und die Messung der Kraft, die von seiner Muskelfasern hergestellt. Die kombinierte Untersuchung der elektrischen und mechanischen Eigenschaften der Motoreinheiten in normalen und genetisch modifizierten Tieren ist ein Durchbruch für das Studium des neuromuskulären Systems.

Serie: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Ein Leitfaden zur<em&gt; In vivo</em&gt; Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.