Die Autoren danken Lisa Hansen und Kirsten Vestergaard für die hervorragende technische Unterstützung sowie P. Scherer, N. Joffin und C. Crewe für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Autoren danken dem UTSW Flow Cytometry Core für die hervorragende Anleitung und Unterstützung bei der Entwicklung der hier beschriebenen Protokolle. R.K.G. wird von NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 und NIDDK R01 DK119163 unterstützt. J.P. wird durch einen Pre-Doctoral Award des Innovation Fund Denmark gesponsert.

Alle Tierprotokolle und -verfahren wurden vom Institutional Animal Use and Care Committee des Southwestern Medical Center der University of Texas genehmigt.
1. Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus gonadalem weißem Fettgewebe
<ol><li>Präparieren Sie das gonadale weiße Fettgewebe von 6-8 Wochen alten Mäusen und legen Sie die Fettpolster in 1x PBS-Lösung.</li>
	<li>Kombinieren Sie bis zu 4 Fettdepots (2-4 Depots von 1-2 Mäusen empfohlen) und zerkleinern Sie das Gewebe in einem 10 mL Becherglas mit 200 μl Verdauungspuffer (1x HBSS, 1,5% BSA und 1 mg/mL Kollagenase D).</li>
	<li>Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 mL Verdauungspuffer.</li>
	<li>Die Mischung bei 37 °C im Wasserbad 1 h lang unter Schütteln inkubieren.</li>
	<li>Filtern Sie das verdaute Gewebe durch ein 100 μm Zellsieb, um unverdautes Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Die filtrierte Probe mit PBS mit 2 % FBS auf 30 mL verdünnen und 5 min bei 4 °C bei 600 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand, der reife Adipozyten enthält.</li>
	<li>Fahren Sie sofort mit der bevorzugten Zellisolationsmethode fort.</li>
</ol>2. Isolierung von APCs und FIPs mittels FACS
<ol><li>Lösen Sie das Pellet in 1 mL 1x RBC-Lysepuffer auf, indem Sie das Röhrchen leicht schütteln.</li>
	<li>1-2 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>10 ml 2 % FBS/PBS zugeben und durch ein 40-μm-Zellsieb in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 400-800 μl 2 % FBS/PBS, das den Fc-Block (1:200) enthält.</li>
	<li>Bei 4 °C 10 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 400 μl bis 800 μl Zellsuspensionen mit ≤106 Zellen pro ml auf 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie Antikörper hinzu. Die Antikörperkonzentrationen sind im Abschnitt Materialtabelle aufgeführt.<ol><li>Bereiten Sie separate Kontrollröhrchen für 1) ungefärbte Zellen, 2) einfarbige Kontrollen und 3) FMO-Kontrollen (Fluoreszenz minus eins) vor.</li>
		<li>Färben Sie die Proben mit PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C Antikörpern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Medien aspirieren und Zellen in 400 μl 2 % FBS/PBS resuspendieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien und resuspendieren Sie die Zellen in 400-800 μl mit 2 % FBS/PBS. Führen Sie sie dann durch 40 μm Filterkappen in 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen für FACS.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte für das Gating aus.<ol><li>Verwenden Sie fleckenfreie und einfarbige Regler zur Kompensation.</li>
		<li>Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um experimentelle Gatter festzulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie die in Abbildung 1 gezeigte Gating-Strategie, um APCs und FIPs zu erhalten. Gate APCs als CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- und FIPs als CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ Zellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie sortierte Zellen in Röhrchen mit 500 μl 100 % Serum und halten Sie die Zellen auf Eis.</li>
	<li>Zellen bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Fügen Sie 2% FBS/PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, indem Sie erneut bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, verwenden Sie die pelletierten Zellen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in dem entsprechenden Volumen des gonadalen APC-Kulturmediums (für die Zellkultur) oder einem geeigneten Puffer für die anschließende Analyse.</li>
</ol>3. Immunomagnetische Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen
<ol><li>Isolieren Sie SVF aus gonadalem weißem Fettgewebe gemäß den Schritten 1.1-1.7.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das SVF-Pellet in 10 mL 1x handelsüblichem MS-Puffer.</li>
	<li>Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 100 μl 1x MS-Puffer.</li>
	<li>Führen Sie die CD31+ - und CD45+ -Zelldepletion wie unten beschrieben durch (Abbildung 2A, Schritt 1). Dies geschieht, um endotheliale und hämatopoetische Zellen zu entfernen.<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und stellen Sie die Konzentration auf ≤ 1 x 108 Zellen/ml ein.</li>
		<li>Die Biotin-konjugierten CD31- und CD45-Antikörper in der Zellsuspension jeweils in einer Konzentration von ≤ 0,25 μg pro 106 Zellen zugeben und 15 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 4 mL 1x MS Puffer.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Den Überstand aspirieren und das Pellet mit 100 μl 1x MS-Puffer resuspendieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 μl Streptavidin-Nanokügelchen hinzu und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 4 mL 1x MS-Puffer.</li>
		<li>Bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand ansaugen.</li>
		<li>Die Zellen werden in 2,5 mL 1x MS-Puffer resuspendiert und in ein 5 mL Polypropylen-Röhrchen überführt.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr für 5 Minuten in das Magnetgestell.</li>
		<li>Sammeln Sie unmarkierte Zellen, indem Sie die Zellsuspension in ein sauberes 15-ml-Zentrifugenröhrchen gießen. HINWEIS: Vermeiden Sie das Schütteln oder Abtupfen von hängenden Tröpfchen, da dies zu einer Kontamination durch unerwünschte Zellfraktionen führt.</li>
		<li>Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und wiederholen Sie die Schritte 3.6.9. bis 3.6.11. Zwei weitere Male für insgesamt 3 Wäschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen (Abbildung 2A, Schritt 2)<ol><li>Arbeiten Sie weiter mit der unmarkierten Fraktion (z. B. CD45-CD31-Fraktion).</li>
		<li>Das 15-ml-Röhrchen mit den unmarkierten Zellen wird 5 Minuten lang bei 4 °C bei 600 x g zentrifugiert.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl 1x MS-Puffer.</li>
		<li>Biotin-konjugierte LY6C- bzw. CD9-Antikörper in einer Konzentration von ≤ 0,25 μg pro 106 Zellen zugeben und 15 min auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 3.6.3 aus. bis 3.6.12. , um die zweite Trennung abzuschließen.</li>
		<li>Sammeln Sie ungebundene Fraktionen. Unmarkierte Zellen (LY6C-CD9-) stellen eine adipogene Fraktion dar, die APCs enthält (Abbildung 2A, Schritt 3).</li>
		<li>Röhrchen aus dem Magneten nehmen, gebundene Zellen resuspendieren und in 1x MS-Puffer eluieren. Eluate oder markierte Fraktion (LY6C+ CD9+) stellt eine nicht-adipogene Fraktion dar, die FIPs enthält (Abbildung 2A, Schritt 3).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie markierte und unmarkierte Fraktionen bei 600 x g für 5 min und pelletieren Sie die Zellen bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Fahren Sie sofort mit der Zellkultur fort (Schritt 6) oder verwenden Sie undifferenzierte Vorläufer für bevorzugte Analysen (Schritt 4 und/oder Schritt 5).</li>
</ol>4. Bewertung der Reinheit von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Resuspendieren Sie bead-isolierte Zellfraktionen in 200-400 μl 2 % FBS/PBS mit Fc-Block (1:200).</li>
	<li>Bei 4 °C 10 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie Antikörper hinzu. Die Antikörperkonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt.<ol><li>Bereiten Sie separate Kontrollröhrchen für 1) ungefärbte Zellen, 2) einfarbige Kontrollen und 3) FMO-Kontrollen vor.</li>
		<li>Fügen Sie den Proben CD45-, CD31-, CD9- und LY6C-Antikörper hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Bei 600 x g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Überstand aspirieren und resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl 2 % FBS/PBS.</li>
	<li>Die Suspension bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 400-800 μl 2 % FBS/PBS. Filtern Sie durch 40 μm Filterkappen in 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen für die Analyse durch Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung der Reinheit<ol><li>Verwenden Sie fleckenfreie und einfarbige Regler zur Kompensation.</li>
		<li>Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um experimentelle Gatter festzulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie die Gating-Strategie für aktive Zellen und einzelne Zellen, wie in Abbildung 2B gezeigt.</li>
		<li>Führen Sie das Gating wie in Abbildung 2B für CD45, CD31, LY6C und CD9 dargestellt durch.</li>
		<li>Verwenden Sie Durchflusszytometrie-Software, um die Häufigkeiten von CD45-, CD31-, LY6C-, CD9-Zellen (APCs) und CD45-CD31-LY6C+-Zellen (FIPs) innerhalb isolierter Fraktionen zu bewerten.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR zur Beurteilung der Reinheit von FIPs und APCs
<ol><li>Extrahieren Sie mRNA aus magnetisch oder FACS-isolierten Zellen mit einem handelsüblichen Extraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Verwenden Sie 1 μg RNA zur Synthese von cDNA mit einem cDNA-Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle), indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.</li>
	<li>Bestimmung der relativen mRNA-Spiegel von APC- und FIPs-selektiven Genen (Tabelle 1) durch quantitative PCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Master Mix.<ol><li>Richten Sie die Probenreaktion für die PCR wie folgt ein: 5 μl 2x SYBR grüner Farbstoff, 1 μl cDNA (~50 ng/ μL), 0,5 μl jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers (10 μM) und 3 μl Wasser.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden Standard-PCR-Bedingungen für den quantitativen PCR-Lauf: Haltephase: 50 °C für 2 Minuten, 95 °C für 10 Minuten; PCR-Stufe (40 Zyklen): 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalisieren Sie die Werte auf die Werte des Haushaltsgens (Rps18), indem Sie ΔΔ-Ct berechnen.</li>
	<li>Um die statistische Signifikanz zu bewerten, führen Sie den ungepaarten Student's t-Test durch.</li>
</ol>6. Zellkultur und Differenzierung
<ol><li>Zentrifugieren Sie magnetisch oder FACS-isolierte Zellen bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl gonadalem APC-Kulturmedium und plattieren Sie 40 K Zellen/Well aus jeder Fraktion in einer 48-Well-Kulturplatte.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium alle 1-2 Tage. APCs beginnen, sich in Adipozyten zu differenzieren, wenn sie sich der Konfluenz nähern. FIPs, die in denselben Medien aufbewahrt werden, sind resistent gegen Adipogenese.</li>
</ol>

<ol>
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T.A.P. ist Mitarbeiter und Anteilseigner von Novo Nordisk A/S

Der C57BL/6-Stamm von Mäusen ist der am häufigsten verwendete Mausstamm in Studien zu ernährungsbedingter Adipositas. C57BL/6-Mäuse nehmen schnell an Gewicht zu, wenn sie auf eine fettreiche Diät (HFD) gesetzt werden, und entwickeln einige der herausragenden Merkmale des metabolischen Syndroms, die mit Fettleibigkeit verbunden sind (z. B. Insulinresistenz und Hyperlipidämie). Bemerkenswert ist, dass die WAT-Expansion, die in Verbindung mit der Fütterung mit fettreicher Diät (HFD) auftritt, depotspezifisch auftrit...

Weißes Fettgewebe (WAT) stellt die Hauptstelle für die Energiespeicherung bei Säugetieren dar. In diesem Gewebe speichern Adipozyten oder "Fettzellen" überschüssige Kalorien in Form von Triglyceriden, die in großen unilokulären Lipidtröpfchen verpackt sind. Darüber hinaus sezernieren Adipozyten eine Vielzahl von Faktoren, die verschiedene Aspekte der Energiehomöostase regulieren 1,2,3. Adipozyten machen den Großteil des WAT-Volumens aus; Adipozyten machen jedoch nur weniger als 50 % der Gesamtzellen aus, die in WAT 4,5 gefunden werden. Das nicht-adipozyten-Kompartiment der WAT oder stromal-vaskulären Fraktion (SVF) ist recht heterogen und enthält vaskuläre Endothelzellen, geweberesidente Immunzellen, Fibroblasten und Adipozyten-Vorläuferzellpopulationen (APC).
WAT ist außergewöhnlich in seiner bemerkenswerten Fähigkeit, mit steigender Nachfrage nach Energiespeichern zu expandieren. Die Aufrechterhaltung dieser Gewebeplastizität ist von entscheidender Bedeutung, da eine angemessene Speicherung von Lipiden in WAT vor schädlicher ektopischer Lipidablagerung in Nicht-Fettgewebe schützt6. Die Art und Weise, wie die einzelnen WAT-Depots diese Expansion als Reaktion auf einen Kalorienüberschuss erfahren, ist eine kritische Determinante für die Insulinsensitivität bei Fettleibigkeit7. Die pathologische WAT-Expansion, die bei adipösen Personen mit metabolischem Syndrom beobachtet wird, ist durch eine bevorzugte Expansion der viszeralen WAT-Depots auf Kosten des metabolisch günstigen subkutanen Fettgewebes gekennzeichnet. Darüber hinaus ist die Insulinresistenz bei Adipositas mit einem pathologischen Umbau der WAT verbunden. Dies ist gekennzeichnet durch hypertrophes Wachstum der vorhandenen Adipozyten (Vergrößerung), unzureichende Angiogenese, chronische metabolische Entzündung, Akkumulation extrazellulärer Matrixkomponenten (Fibrose) und Gewebehypoxie 8,9. Diese WAT-Phänotypen der Adipositas sind mit Lebersteatose und Insulinresistenz verbunden, ähnlich wie bei der Lipodystrophie (Fehlen einer funktionellen WAT). Im Gegensatz dazu wird eine gesunde WAT-Expansion in der metabolisch gesunden adipösen Population beobachtet und ist durch eine bevorzugte Expansion der protektiven subkutanen WAT und eine Depotexpansion durch Adipozytenhyperplasie gekennzeichnet10. Die Rekrutierung neuer Adipozyten wird durch die De-novo-Differenzierung von Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) (als "Adipogenese" bezeichnet) vermittelt. Die Adipozytenhyperplasie fällt mit einem relativ niedrigeren Grad der WAT-Fibrose und der metabolischen Entzündung zusammen 6,11. Eine Vielzahl von Zelltypen innerhalb der WAT-Mikroumgebung beeinflussen direkt die Gesundheit und Erweiterbarkeit von WAT bei Adipositas12. Daher hat die Definition der Funktion der verschiedenen Zelltypen, die in WAT vorhanden sind, nach wie vor eine hohe Priorität für das Feld.
In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Strategien eingesetzt, um native APCs aus Mensch und Maus zu definieren und zu isolieren WATSVF 13. Bei solchen Strategien werden APCs basierend auf der Zelloberflächenexpression gemeinsamer mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellmarker unter Verwendung von Antikörper-basierten Zelltrennungstechniken isoliert. Zu diesen Ansätzen gehören die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit fluorophormarkierten Antikörpern oder die immunomagnetische Bead-Trennung (d. h. chemisch modifizierte Antikörper). Zu den Zelloberflächenproteinen, die für die Isolierung von APCs vorgesehen sind, gehören PDGFRα, PDGFRβ, CD34 und SCA-1. Diese Ansätze haben dazu beigetragen, APCs zu bereichern; Die Zellpopulationen, die auf der Grundlage dieser Marker isoliert werden, sind jedoch recht heterogen. Jüngste Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA-seq) haben die molekulare und funktionelle Heterogenität von Stromazellen innerhalb der isolierten stromal-vaskulären Fraktion (SVF) der murinen WAT 14,15,16,17 hervorgehoben. Aus unseren eigenen scRNA-seq- und funktionellen Analysen haben wir funktionell unterschiedliche immunmodulierende und adipogene PDGFRβ+ perivaskuläre Zellsubpopulationen im stromalen Kompartiment von intraabdominalen WAT bei adulten Mäusen identifiziert und charakterisiert15. Fibroinflammatorische Vorläufer (FIPs) stellen eine prominente Subpopulation von PDGFRβ+-Zellen dar und können auf der Grundlage der LY6C-Expression (LY6C+ PDGFRβ+-Zellen) isoliert werden15. FIPs fehlt es an adipogener Kapazität, sie üben eine starke entzündungsfördernde Reaktion auf verschiedene Reize aus, produzieren Kollagen und sezernieren anti-adipogene Faktoren15. Die proinflammatorische und fibrogene Aktivität dieser Zellen nimmt in Verbindung mit Fettleibigkeit bei Mäusen zu, was diese Zellen als Regulatoren des WAT-Umbaus impliziert. Die LY6C-CD9-PDGFRβ+-Subpopulation repräsentiert Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs). Diese APCs sind in der Expression von Pparg und anderen pro-adipogenen Genen angereichert und differenzieren sich in vitro und in vivo leicht zu reifenAdipozyten 15. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung dieser unterschiedlichen Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse unter Verwendung von FACS und die immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern zur Verfügung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um funktionell unterschiedliche Fettvorläufer-Subpopulationen aus mehreren intraabdominalen WAT-Depots von adulten männlichen und weiblichen Mäusen zu isolieren15. Die isolierte Untersuchung dieser funktionell unterschiedlichen Zellpopulationen kann wesentlich zu unserem aktuellen Verständnis der molekularen Mechanismen beitragen, die die Adipogenese und den Umbau des intraabdominalen Fettgewebes bei Gesundheit und Krankheit regulieren.
Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von adipösen Vorläuferzellen aus murinen Nebenhoden-WAT; Das gleiche Verfahren kann jedoch verwendet werden, um entsprechende Zellen aus dem mesenterialen und retroperitonealen WAT-Depot sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse zu isolieren15. Ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung und Isolierung dieser Depots bei Mäusen findet sich in Bagchi et al.18. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung von Mäusen im Alter von 6-8 Wochen optimiert. Die Häufigkeit und Differenzierungsfähigkeit von APCs kann im Zusammenhang mit dem Altern abnehmen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 and 100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340/352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer (for 10mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 g BSA (1.5 % final cc.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purity Check and FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block (Mouse CD16/CD32)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103103</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102503</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: MEC13.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD9</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124803</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: MZ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin LY6C</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128003</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102419</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103131</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD140b PDGFR&#946;-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136006</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:50 
			Species: Mouse 
			Clone: APB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY6C-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128016</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124808</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: MZ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture and Differentiation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gonadal APC Culture media (for 500mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>288 mL DMEM with 1 g/L glucose</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>192 mL MCDB201</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL 100% ITS premix</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L 100 g/ml FGF-basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3139-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots

Die stroma-vaskuläre Fraktion (SVF) des weißen Fettgewebes (WAT) ist bemerkenswert heterogen und besteht aus zahlreichen Zelltypen, die funktionell zur Expansion und zum Umbau von WAT im Erwachsenenalter beitragen. Ein enormes Hindernis für die Untersuchung der Auswirkungen dieser zellulären Heterogenität ist die Unfähigkeit, funktionell unterschiedliche Zellsubpopulationen aus WAT SVF für in vitro- und in vivo-Analysen zu isolieren. Die Einzelzellsequenzierungstechnologie hat kürzlich funktionell unterschiedliche fibroinflammatorische und adipogene PDGFRβ+ perivaskuläre Zellsubpopulationen in intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse identifiziert. Fibroinflammatorische Vorläuferzellen (als "FIPs" bezeichnet) sind nicht-adipogene Kollagen produzierende Zellen, die einen entzündungsfördernden Phänotyp ausüben können. PDGFRβ+ Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) sind sowohl in vitro als auch in vivo nach Zelltransplantation stark adipogen. In dieser Arbeit beschreiben wir mehrere Methoden zur Isolierung dieser stromalen Zell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen WAT-Depots. FIPs und APCs können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder durch Nutzung der auf biotinylierten Antikörpern basierenden immunomagnetischen Bead-Technologie isoliert werden. Isolierte Zellen können für molekulare und funktionelle Analysen verwendet werden. Die isolierte Untersuchung der funktionellen Eigenschaften der Stromazell-Subpopulation wird unser aktuelles Wissen über den Umbau von Fettgewebe unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen auf zellulärer Ebene erweitern.

Dieses Protokoll beschreibt zwei Strategien, die die Isolierung unterschiedlicher stromaler Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse ermöglichen. APCs und FIPs können durch FACS (Abbildung 1) oder immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern (Abbildung 2) isoliert werden. Bei beiden Ansätzen werden Reagenzien und Antikörper verwendet, die alle kommerziell erhältlich sind. Die immunomagnetische Kügelchentrennung füh...

Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots at JoVE.com

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.5K Aufrufe.  Novo Nordisk A/S. Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Serie: Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Isolierung von Makrophagen-Teilmengen und Stromalzellen von Menschlichen und Maus-Myokardproben

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs contain both multilocular lipid droplets and abundant mitochondria, and they express uncoupling protein 1 (UCP1). BAs are categorized into two sub-types based on their origin: embryo derived classical BAs (cBAs) and white adipocytes derived BAs. Due to their relatively low density, BAs cannot be isolated from BAT with traditional centrifugation method. In this study, a new method was developed to isolate BAs from mice for gene and protein expression analysis. In this protocol, interscapular BAT from adult mice was digested with Collagenase and Dispase solution, and the dissociated BAs were enriched with 6% iodixanol solution. Isolated BAs were then lysed with Trizol&#160;reagent for simultaneous isolation of RNA, DNA, and protein. After RNA isolation, the organic phase of the lysate was used for protein extraction. Our data showed that 6% iodixanol solution efficiently enriched BAs without interfering with follow-up gene and protein expression studies. Platelet-derived growth factor (PDGF) is a growth factor that regulates the growth and proliferation of mesenchymal cells. Compared to the brown adipose tissue, isolated BAs had significantly higher expression of Pdgfa. In summary, this new method provides a platform for studying the biology of brown adipocytes at a single cell-type level.

This study describes a new method of isolating murine brown adipocytes for gene and protein expression analysis.

Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...