XHP wurde von National Institute of Health (NIH) Zuschüsse aus National Institute on Aging (NIHK01AG024496) und The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530) unterstützt.

1. Lösungs-und Medien-Vorbereitung <ol><li> Gelatin Beschichtungslösung: 0,1% (w / v) Gelatine in ddH 2 O, autoklaviert und bei 4 ° C. </li><li> Matrigel Beschichtungslösungen. Stammlösung: langsam auftauen Matrigel (10 ml) bei 4 ° C über Nacht, 10 ml eiskaltem DMEM oder DMEM/F12, gut mischen und aliquoten 1 ml / Rohr unter sterilisiert Gewebekultur Kapuze, lagern bei -20 ° C. Working-Lösung: langsam auftauen 1 ml Matrigel Aliquot bei 4 ° C für 1-2 Stunden, Transfer zum 14 ml gekühltes DMEM oder DMEM/F12 und gut mischen unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Menschliche Laminin Beschichtungslösung: Verdünnen Sie 1 ml menschlichen Laminin-Lösung (0,5 mg / ml in Tris Buffered NaCl, Lagerung bei -80 ° C, langsam auftauen bei 4 ° C für 1-2 Stunden) mit eiskaltem DMEM oder DMEM/F12 zu 12,5 ml Arbeitslösung (40 ug / ml) unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Wachstumsfaktor Stammlösungen (500-1000X): Man löst growth factor bei 10 ug/ Ml in sterilisierte Puffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% Glycerin, 1XPBS) und speichern als 50-100 &amp;mgr; l / Röhrchen aliquotiert bei -80 ° C. </li><li> All-trans-Retinsäure Arbeitslösung (1000X): 10 mM in DMSO, speichern in Aliquots bei -80 ° C. </li><li> HESC Medien: DMEM/F12 oder KO-DMEM (80%), KO Serumersatz (20%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MEM nicht essentielle Aminosäuren (MNAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C mit 20 ng / ml bFGF vor der Verwendung ergänzt. Oder ersetzen Sie &quot;knock out (KO) Serum-Ersatz&quot; mit definierten Komponenten: DMEM/F12 oder KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM wesentliche Aminosäuren (MEAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C, mit bFGF (20 ng / ml), Insulin (20 ug / ml), Ascorbinsäure (50 ug / ergänzt ml), Human Aktivin A (50 ng / ml), Humanalbumin / Albumax (10 mg / ml), und menschliches Transferrin (8 pg / ml) vor der Verwendung. </li><li> NSC Medien: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), Heparin (8 pg / ml). </li></ol> 2. Plattenbeschichtung <ol><li> Coat-Platten mit Gelatine: 2,5 ml / well der Gelatine-Lösung bis 6-Well-Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Coat-Platten mit Laminin: chill Gelatine beschichteten Platten und entfernen Gelatine, 2,5 ml / well Matrigel oder menschliche Laminin-Beschichtung funktionierende Lösung zu vorgekühlte verkleistert 6-Well-Platten und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 3. Passagieren und Seeding Undifferenzierte hESCs unter definierten Bedingungen <ol><li> Lassen hESC Kolonien wachsen auf 5-7 Tage alt, und nehmen Sie hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. </li><li> Wählen Sie hESC Kolonien aufgeteilt werden. Morphologisch sind diese Kolonien&gt; 75% undifferenzierte hES (kleine kompakte Zellen), in der Regel leicht opake (nicht weißen aufgehäuften Zellen nicht klar differenzierten Zellen) mit definierten Rand un habenderneath dem Binokular. Vorsichtig einen Überblick über die ausgewählten Kolonien und entfernen differenzierten Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie und alle differenzierten Teile (falls vorhanden) der Kolonie mit der Schärfe des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. (Bitte beachten Sie, pluripotenten hES auf eine vorübergehende Phase, eine spontane Differenzierung selbst unter optimalen Bedingungen, obwohl bevorzugt, es schwierig festzustellen, Thesen Zellen sind 100% undifferenzierte unter Binokular,&gt; 75% undifferenziert sind in der Regel als der Pass Punkt betrachtet. Die differenzierten Zellen in der Regel nicht Samen und weiter wachsen, beseitigt in der Passage-Prozess) </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende differenzierten Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF. </li><li> Schneiden Sie die undifferenzierte hES-Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare.</li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und Pool zusammen. </li><li> Saugen Sie das Matrigel oder menschliche Laminin-Lösung von dem beschichteten frischen Platten. Aliquot 4 ml / well hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-Well-Platte. Gently Transfer der Platte Inkubator ohne Schütteln und lassen Kolonie Stücke Samen über Nacht, ohne zu stören in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li></ol> 4. Neuronale Induktion von hESCs unter definierten Kultur-System mit Retinsäure <ol><li> Am Tag 3 nach der Aussaat, die Abschaffung der meisten alten Medien aus jedem Well der Platte und lassen genug Medien zu ermöglichen hESC Kolonien unter Wasser (niemals zulassen hESCs austrocknen) werden. Ersetzen mit 4 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 uM Retinsäure. </li><li> Ersetzen Sie die alten Medien mit frischen hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und10 uM Retinsäure jeden zweiten Tag, und lassen neural-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien wachsen zu Tag 7 oder 8. Alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die auch weiterhin vermehren wird. Die Kolonien werden in der Größe zu erhöhen, um die Platte am Tag 7 oder 8 abdecken, und die Zellen beginnen, häufen sich in einigen Gebieten der Kolonien. </li></ol> 5. Continuing Neuronale Differenzierung in Suspensionskultur <ol><li> Nehmen hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Vorsichtig einen Überblick über die Kolonien und entfernen Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie (differenzierte Zellen aus der Kolonie eingewandert) mit dem Rand des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende Fibroblasten-Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien (ohne bFGF). </li><li> Schneiden Sie die neural-induced hESC Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien (ohne bFGF) und Pool zusammen. </li><li> Aliquot 4 ml / well serumfreiem hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte und inkubieren bei 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit schwimmende zellulären Clustern (Neuroblasten) für 4-5 Tage zu bilden. </li></ol> 6. Neuronalen Phänotyp Reifung in Adhesive Kultur <ol><li> Pool der Medien mit schwimmenden Neuroblasten zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugation bei 1400 rpm für 5 min. Saugen Sie die alten Medien so viel wie du kannst, und fügen Sie die gleiche Menge frischen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipette auf und ab zu schweben Neuroblasten und aliquoten 4 ml / well bis 6-Well-Platten mischen. Die Neuroblasten können auch an sich seineded in einem Laminin / Kollagen (Matrigel) oder menschliche Laminin polymerisiert 3-dimensionale Matrix in serum-freien NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) . Übertragen Sie die Platten auf eine 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit Neuroblasten zu befestigen Nacht. </li><li> Ersetzen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) jeden zweiten Tag. Umfangreiche Netzwerke von Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen beginnen, innerhalb von 2 Wochen kontinuierlichen Kultivierung und Erhöhung der Zahl mit der Zeit auftreten, und könnten für über 3 Monate aufrechterhalten werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Retinsäure (RA) dargestellt wird ausreichen, um hESCs in den definierten Kultur-System zum Übergang erhalten von Pluripotenz ausschließlich auf eine neuroektodermalen Phänotyp (Abb. 2A) zu induzieren. Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu RA werden alle Zellen innerhalb des Koloniemorphologie Veränderungen zu unterziehengroßen differenzierten Zellen, die zum Ausdruck Pluripotenz-assoziierter Marker nicht mehr, wie durch Oct-4, und beginnen Ausdruck verschiedener Neuroektoderms-assoziierte Marker wie HNK1, AP2, und TrkC (Abb. 2B). Diese großen differenzierten Zellen wird auch weiterhin zu vermehren und die Kolonien an Größe zunehmen, ausgehend spontan auf den frühen neuronalen Marker β-III-Tubulin (Abb. 2B) auszudrücken. Die reiferen neuronalen Marker MAP-2 beginnen, in den Gebieten der Kolonien, in denen Zellen auf (Abb. 2B) angehäuft haben scheinen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung wird die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1, in dopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH) Gen 16 verwickelt, in den Zellkern (Abb. 2B) zu verlagern. Nach losgelöst, wird der RA-Behandlung hESCs schwimmenden zellulären Clustern (Neuroblasten) in einer Suspension Kult Formure auf die neuronale Differenzierung fortzusetzen. Nach dem Entfernen von bFGF und nach erlaubt die Neuroblasten zu einer Gewebekultur Platte oder in einem Laminin / Kollagen polymerisiert 3-dimensionale Matrix in einem serumfreien Medium definiert, β-III-Tubulin-und Map-2-Expression, Neuriten ausgesät legen -tragenden Zellen und pigmentierten Zellen werden beginnen, mit einer drastischen Steigerung der Effizienz als die spontane multi-lineage Differenzierung von hES ohne Behandlung über den gleichen Zeitraum im Vergleich erscheinen und könnte für mehr als 3 Monate (Abb. 2C) aufrechterhalten werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> Abbildung 1 Eine schematische Darstellung gut kontrollierten effiziente Induktion von menschlichen pluripotenten Stammzellen ausschließlich zu einem bestimmten klinisch relevanten Linie durch eine einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> Abbildung 2 <strong&gt; Retinsäure induziert neuronale Linie Spezifikation und neuronale Progression direkt von Pluripotenz unter definierten Bedingungen. (A) Schematische Darstellung des Protokolls Zeit Linie gerichtet neuronalen Differenzierung von hES. (B) Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu Retinsäure (RA) unter den definierten Kultur, großer differenzierte Oct-4 (rot)-negativen Zellen innerhalb der Kolonie begann zu entstehen, im Vergleich zu mock-behandelt (DMSO) hESCs als Kontrolle . RA-induzierte differenzierte Oct-4-negativen Zellen begannen sich zu äußern HNK-1 (rot), AP2 (rot), TrkC (grün), und dann β-III-Tubulin (rot), im Einklang mit frühen neuroektodermalen Differenzierung. Diese Zellen weiter zu reifen letztlich Ausdruck der neuronalen Marker Map-2 (grün), in der Regel in Bereichen, in denen Zellen begannen sich zu häufen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung, die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1 (grün), in Verbindung gebrachtdopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Gen, in den Zellkern transloziert. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau dargestellt). (C) RA-Behandlung induziert die Differenzierung in Richtung eines neuronalen Linie mit hoher Effizienz durch umfangreiche Netzwerke von Neuriten-tragenden Zellen, die β-III-Tubulin (rot) und Map-2 (grün, in einem 3-dimensionale Matrix dargestellt) beurteilt. Die Pfeile zeigen die pigmentierten Zellen typisch für jene im ZNS. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau) in den Einsätzen gezeigt. Maßstabsbalken: 0,1 mm.

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, konkurrierende Interessen. XHP ist der Gründer der Xcelthera. XHP und EYS haben geistigem Eigentum im Zusammenhang mit hESCs.

Eine der großen Herausforderungen für Entwicklungs-Studie und klinische Umsetzung wurde, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten menschlichen Stammzellen zu einem gewünschten Phänotyp effizient und vorhersagbar Kanal. Obwohl diese Zellen spontan differenzieren können in vitro in Zellen aller Keimblätter, indem Sie durch ein Multi-Linie aggregierte Bühne, verfolgen nur ein kleiner Teil der Zellen einer bestimmten Abstammungslinie 1,4. In diesen hESC-derived Aggregate, das gleichzeitige Auftreten einer erheblichen Menge von sehr unterschiedlichen unerwünschten Zelltypen, die in drei embryonalen Keimblätter aufhalten dürfen oft macht die Entstehung des gewünschten Phänotypen nicht nur ineffizient, sondern unkontrollierbare und unzuverlässig als auch. Obwohl Herz-und neuronalen Linien in früheren Berichten abgeleitet worden, aber nach der Ineffizienz bei der Erzeugung von spezialisierten Zellen durch Keimblattes-Induktion von pluripotenten Zellen und das hohe Risiko der Tumorigenität transplantation haben weitere klinische Übersetzung behindert. Die hESC Linien zunächst abgeleitet wurden und gepflegt in Co-Kultur mit Wachstum verhaftet embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) 4. Obwohl mehrere Menschen Feeder, Feeder-frei, und chemisch formulierter Kultur für hESCs 11-13, die entwickelt wurden, die Elemente notwendig und hinreichend für die Erhaltung der Selbst-Erneuerung der menschlichen pluripotenten Zellen bleiben ungelöst. Diese exogenen Feeder-Zellen und biologischen Reagenzien helfen, die langfristig stabile Wachstum der undifferenzierte hES während Maske die Fähigkeit von pluripotenten Zellen zu Entwicklungsstörungen Signale zu reagieren. Die Aufrechterhaltung undifferenzierten Zellkulturen in einem definierten Biologika-freien Kultur, das treue Expansion und steuerbare Differenzierung erlaubt ist einer der Schlüssel zu ihrem therapeutischen Nutzen und Potential. RA war nicht ausreichend, um die neuronale Differenzierung von undifferenzierten hES unter zuvor berichtet condit gepflegt induzierenIonen mit exogenen Feeder-Zellen. Obwohl neuronale Linien in einem relativ frühen Stadium in hESC Differenzierung erscheinen, Behandlung hESC differenzierte multi-lineage Aggregate (Embryoidkörpern) mit RA nur geringfügig erhöht die geringe Ausbeute von Neuronen 1, 14, 15. Um einheitlich Umwandlung von menschlichen pluripotenten Stammzellen zu einer bestimmten Linie zu erreichen, verwendeten wir eine definierte Kultur System in der Lage für die Versicherung der Proliferation von undifferenzierten hES, die Bedingungen für gut kontrollierte effiziente Induktion von pluripotenten hES ausschließlich zu identifizieren, um eine bestimmte klinisch relevante Linie durch einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen (Abb. 1, Abb. 2).. Zukünftige Studien werden genetische und epigenetische Kontrolle Moleküle in menschlichen ZNS-Entwicklung zeigen, als Alternativen, die den Weg für kleines Molekül-vermittelten direkten Kontrolle und Modulation der hESC pluripotent Schicksal bereiten bei der Ableitung von klinisch relevanten Linien für regenerative Therapien. Ohne RA-Behandlung, 1-5% HESCs wird spontane Differenzierung in Neurone 1, 14, 15 zu unterziehen. Mit RA-Behandlung haben wir in der Lage,&gt; 95% embryonalen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus hES unter define Kultur in einem Prozess, menschliche embryonale Entwicklung 14 emulieren könnte aufrechterhalten zu generieren. Kürzlich haben die bekannten neuronalen Schicksal bestimmen Gene verwendet worden, um Maus-Fibroblasten in adulten neuralen Vorläuferzellen und Neuronen mit einem niedrigen Wirkungsgrad von 0,5-8% 17, 18 transdifferenzieren. Allerdings haben umprogrammiert Körperzellen historisch mit abnormen Genexpression und beschleunigte Seneszenz mit eingeschränkter therapeutischen Nutzen 19-21 in Verbindung gebracht. Schließlich das Protokoll gründeten wir hier zu pluripotenten hES aus der inneren Zellmasse (ICM) oder Epiblast des menschlichen Blastozyste 4 abgeleitet begrenzt, darf nicht auf andere pluripotente Zellen, einschließlich Tier-Ursprung WSR WSR aus früheren Morula gewonnen (acht gelten -cell)-Embryonen 22 und Artificially umprogrammiert Zellen 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Growth Faktor reduziert </td></tr><tr><td> Menschliche Laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all-trans-Retinsäure </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM nicht essentielle Aminosäure-Lösung (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM einminosäuren Lösung (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliches Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human-Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF-450 bis 02 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-1 bis 200 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche NT-3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 Supplement (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Es gibt einen großen unerfüllten Bedarf an einer klinisch-geeigneten menschlichen Nervenzellen Quelle für die Reparatur oder Regeneration des geschädigten zentralen Nervensystems (ZNS) Struktur und Schaltungen in der heutigen Healthcare-Industrie. Zell-basierte Therapien vielversprechend, um die verlorenen Nervengewebe und Funktion für ZNS-Störungen wiederherzustellen. Allerdings haben Zelltherapien auf ZNS-derived neuralen Stammzellen Supply Einschränkung und Schwierigkeit, im klinischen Umfeld aufgrund ihrer begrenzten Expansion in Kultur und mangels Plastizität nach umfangreichen Passage 1-3 anzutreffen sind. Trotz einiger positiven Ergebnisse, werden die ZNS-derived menschliche neurale Stammzellen (hNSCs), um ihre therapeutische Wirkung vor allem durch ihre nicht-neuronalen Nachkommen ausüben durch die Herstellung von trophischen und neuroprotektive Moleküle zur Rettung des körpereigenen Zellen 1-3. Alternativ pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen (hES) anbieten Heilmittel für eine Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, die durch supplying die Vielfalt der menschlichen neuronalen Zelltypen im ZNS für die Regeneration 1,4-7. Allerdings hat, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES effizient und vorhersagbar Kanal zu einem gewünschten Phänotyp eine große Herausforderung sowohl für Entwicklungs-Studie und klinische Übersetzung worden. Herkömmliche Ansätze beruhen auf multi-lineage Neigung von pluripotenten Zellen durch spontane Keimblatt Differenzierung, was ineffizient und unkontrollierbare Linie-Engagement, das oft durch phänotypische Heterogenität und Instabilität, damit ein hohes Risiko für Tumorigenität 7-10 gefolgt. Darüber hinaus können ausländische undefined / Tier biologische Zusatzstoffe und / oder Anleger, die typischerweise für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von hES verwendet wurden um direkte Verwendung solcher Zellen spezialisiert Transplantaten in Patienten problematisch 11-13. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Elemente einer definierten Kultur-System gelöst notwendig und ausreichend für sustaining Epiblast Pluripotenz von hES und dient als Plattform für die de novo Ableitung von klinisch-geeignet hESCs und effektiv leiten wie hESCs gleichmäßig in Richtung klinisch relevanter Linien durch kleine Moleküle 14 (siehe schematischer in Abb. 1).. Retinsäure (RA) nicht induziert neuronale Differenzierung von undifferenzierten hES am Anleger 1, 14 gehalten. Und im Gegensatz zu Maus ES-Zellen, die Behandlung hESC differenzierte Embryoidkörpern (EVG) nur geringfügig erhöht die geringe Ausbeute von Neuronen 1, 14, 15. Doch nach Screening einer Vielzahl von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, fanden wir, dass solche definierten Bedingungen Retinsäure (RA) ausreichen, um die Spezifikation von Neuroektoderms direkt aus pluripotenten hES, die weiter zu Neuroblasten, dass menschliche neuronale Vorläuferzellen und Neuronen in der generierten fortgeschritten induzieren gemacht ZNS mit hohem Wirkungsgrad (Abb. 2). Wir definierten Bedingungen für die Induktion von neuroBlasten direkt aus pluripotenten hES ohne Zwischenschaltung einer multi-lineage Embryoidkörper Bühne, so dass gut kontrollierte effiziente Ableitung der einen großen Vorrat an menschlichen Nervenzellen im gesamten Spektrum der Entwicklungsstadien für die Zell-basierter Therapeutika.

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

efficient-derivation-human-neuronal-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Aufrufe.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Serie: Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...