Mit diesem Protokoll kann die Frage beantwortet werden, ob und wie sich Hydraulic Fracturing auf Bakterien in nahegelegenen Bächen und damit auf die Bäche selbst auswirkt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre ganzheitliche Natur, da sie den Forscher von der Probenentnahme bis zur Datenanalyse führt. Jeremy Chansee, bioinformatischer Informatiker in meinem Labor, Sydney Regal, Student am Juniata College, und Gillian Leister, meine Laborleiterin, werden das Verfahren demonstrieren.
Um Sedimentproben für die Nukleinsäureextraktion zu sammeln, tauchen Sie mit Handschuhen ein verschlossenes, steriles 50-Milliliter-Konusrohr vom Ufer in das Bachwasser. Während das Rohr untergetaucht ist, entfernen Sie die Kappe und schaufeln Sie mit der Kappe etwa drei Milliliter Sediment aus einer Tiefe von ein bis drei Zentimetern in das Rohr. Nachdem Sie die Probe entnommen haben, entsorgen Sie alle bis auf etwa einen Milliliter Wasser aus dem Röhrchen und verwenden Sie eine 1.000 Mikroliter Pipette, um drei Milliliter DNA / RNA-Konservierungsmittel in die Probe zu geben.
Schwenken Sie das verschlossene konische Röhrchen fünf Sekunden lang, um das Konservierungsmittel gründlich zu mischen und die Probe zu entwerten und auf Eis zu lagern. Nach der Rückkehr ins Labor lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für die 16S-DNA-Analyse oder minus 70 Grad Celsius für die Metatranskriptomik-RNA-Analyse. Für die Filtersammlung eine ganze sterile Ein-Liter-Flasche dreimal vollständig mit Strömungswasser füllen und entleeren, um die Flasche zu konditionieren, bevor Sie die Flasche ein letztes Mal füllen.
Ziehen Sie auf einer stabilen Oberfläche ein volles Volumen Anstromwasser in eine sterile Luer-Lock-Spritze und verbinden Sie die Spritze mit einem sterilen und DNA/RNA-freien Polyethersulfonfilter mit einem Durchmesser von 1,7 Zentimetern und einer Porengröße von 0,22 Mikron. Spülen Sie die gesamte Menge An Bachwasser durch den Filter. Wenn das gesamte Probenvolumen auf die gleiche Weise gefiltert wurde, ziehen Sie etwa 20 Milliliter Luft in die Spritze und drücken Sie die Luft durch den Filter, um überschüssiges Wasser aus dem Filter zu entfernen.
Als nächstes verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um zwei Milliliter DNA / RNA-Konservierungsmittel in die größere Öffnung des Filters zu geben, während Sie den Filter horizontal mit der Spitze der Pipette im Zylinder des Filters halten, um sicherzustellen, dass das Konservierungsmittel in den Filter gelangt. Verschließen Sie dann den Filter mit dicht umwickelten Quadraten aus Paraffinfilm um jede Öffnung und legen Sie den Filter in einen sterilen Probenbeutel auf Eis. Wenn Sie von der Probenahme zurückkehren, lagern Sie die Filter für 16S oder für die metatranskriptomische Analyse, wie gezeigt.
Bevor Sie mit einem Probentransfer beginnen, reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol. Für die Nukleinsäureextraktion aus einer Sedimentprobe verwenden Sie ein flammen- und ethanolsterilisiertes Metallwerkzeug, um etwa 250 Milligramm Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Für die Nukleinsäureextraktion aus einer Filterprobe verwenden Sie einen 70% Ethanol- und flammensterilisierten Schraubstockgriff, um das Filtergehäuse auf der sterilen Oberfläche aufzubrechen und den Kern aus dem Gehäuse zu entfernen.
Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um oben, unten und entlang der Naht des Kerns zu schneiden, und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um das Filterpapier zu falten, bevor Sie es mit dem Skalpell in kleine Stücke schneiden. Anschließend legen Sie die Filterstücke vorsichtig in ein Mikrozentrifugenrohr, ohne unsterilisierte Oberflächen zu kontaktieren. Für die Lyse der Zellen innerhalb beider Probentypen wird das Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit einem Zelldisruptor unterzogen.
Nach mindestens fünf Minuten zentrifugieren Sie die Proben und geben Den Überstand in ein neues steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dem Überstand im Verhältnis eins zu eins einen Lysepuffer hinzu und übertragen Sie die Lösung in den bereitgestellten Filter. Legen Sie den Filter in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dem Röhrchen 400 Mikroliter Präparationspuffer hinzu.
Nach der Zentrifugation 700 Mikroliter Waschpuffer in das Röhrchen geben und den Filter erneut zentrifugieren. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, geben Sie 400 Mikroliter Waschpuffer für eine zusätzliche Zentrifugation in das Rohr und geben Sie den Filter in ein neues steriles Mikrozentrifugenrohr. Um die DNA zu eluieren, behandeln Sie den Filter fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 Mikrolitern DNase/RNase-freiem Wasser.
In der Zwischenzeit einen Drei-HRC-Filter in ein Sammelrohr geben und 600 Mikroliter HRC-Vorbereitungslösung hinzufügen. Nach der Zentrifugation wird der Filter in ein neues steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die eluierte DNA zur Zentrifugation in den Filter überführen. Der Durchfluss enthält die extrahierte DNA.
Um eine DNA 16S RNA-Bibliothek zu erstellen, verwenden Sie zunächst das frisch extrahierte DNA-Produkt für die ribosomale 16S-RNA-Amplifikation mit einem Standard-PCR-Protokoll. Mischen Sie sieben Mikroliter des resultierenden PCR-Produkts und 13 Mikroliter DNase-freies Wasser und laden Sie die PCR-Lösung auf ein 2% iges Agarosegel. Dann lassen Sie das Gel bei 90 Volt für 60 bis 90 Minuten laufen, um nach einer Bandgröße von 386 Basenpaaren als Beweis für eine erfolgreiche Verstärkung zu suchen.
Um die ribosomale DNA 16S-RNA-Bibliothek zu reinigen, bündeln Sie 10 Mikroliter der PCR-Produkte, die helle Bänder ergaben, und 13 Mikroliter der Proben, die schwache Bänder in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen ergaben, und laden Sie etwa 150 bis 200 Nanogramm jeder gepoolten Probe in einzelne Vertiefungen eines neuen 2% Gels. Nachdem Sie das Gel wie gezeigt ausgeführt haben, entfernen Sie die 386 Basenpaarbänder aus dem Gel und verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um die DNA zu reinigen. Dann eluieren Sie die gereinigte DNA mit 30 Mikrolitern 10 Millimolar-Tris-Hydrochlorid und verpacken Sie die gereinigten Bibliotheken in Trockeneis, bevor Sie für die Sequenzierung der nächsten Generation versandt werden.
In dieser repräsentativen Analyse würden alle Extraktionen bis auf eine als erfolgreich bezeichnet. Helle Bänder, die nach der PCR-Amplifikation beobachtet wurden, deuten auf einen Erfolg für das 16S-Protokoll hin. 16S-Proben sollten mindestens 1.000 Sequenzen haben, wobei mindestens 5.000 ideal sein sollten, während metatranskriptsomische Proben mindestens 500.000 Sequenzen haben sollten, wobei mindestens 2 Millionen ideal sein sollten.
Sedimentproben von 21 verschiedenen Standorten an 13 verschiedenen Bächen für 16S und Metatranskriptomik-Analysen werden gezeigt. Von diesen 21 Standorten befanden sich 12 nach der Fracking-Aktivität und wurden als Hydraulic Fracturing Positiv eingestuft, und neun befanden sich entweder stromaufwärts der Fracking-Aktivität oder in einem Wassereinzugsgebiet, in dem Fracking fehlte und als Hydraulic Fracturing negativ eingestuft wurde. Wie durch die PERMANOVA-Analyse bewertet, deutet die beobachtete Trennung zwischen den positiven und negativen Daten des Hydraulic Fracturing darauf hin, dass die positiven Hydraulischen Fracturing-Proben durch Fracking beeinflusst wurden.
Die wichtigsten Random-Forest-Prädiktoren würden zeigen, welche Merkmale für die korrekte Differenzierung von Stichproben am wichtigsten sind. Wenn ein Taxon durch das Random-Forest-Modell als wichtig identifiziert wird, könnte sein antimikrobielles Resistenzprofil in hydraulischen Fracturing-positiven Proben mit seinem Profil in hydraulischen Fracturing-negativen Proben verglichen werden. Wenn sie sich stark unterscheiden, könnte das darauf hindeuten, dass Fracking-Flüssigkeit, die Biozide enthält, in den Strom gelangt ist.
Mikroben sind überall, daher ist die Kontamination ein erhebliches potenzielles Problem bei dieser Art von Arbeit. Die ersten Probentransferschritte sind hierfür besonders anfällig. Wenn man sich für mikrobiellen biologischen Abbau oder andere Stoffwechselstoffe interessiert, kann die Schrotflintensequenzierung von RNA verwendet werden, um die aktive mikrobielle Genexpression zu untersuchen.
Diese Technik ermöglicht die Standardisierung molekularer Techniken zur Untersuchung von in-situ-Bakteriengemeinschaften sowie bioinformatische Analysen von Bakteriensequenzdaten.
