Diese Studie stellt ein Protokoll zur Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen vor, das ausschließlich durch Gleichstrompulsstimulation in einem mikrofluidischen System induziert wird. Diese Technik bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbauzeit, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chip für konfokale Mikroskopiebeobachtungen.
Die einfache Gleichstrompulsbehandlung kann das Schicksal der neuronalen Vorläuferzellen der Maus steuern und könnte zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden. Zeichnen Sie zunächst Muster für einzelne PMMA-Schichten und das doppelseitige Band mit entsprechender Software. Schalten Sie den Kohlendioxid-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an.
Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software. Legen Sie die PMMA-Blätter oder das doppelseitige Band auf die Plattform des Laserschreibers und fokussieren Sie den Laser dann mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band. Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und starten Sie dann den Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten.
Entfernen Sie die Schutzfolie von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas. Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stücke von einem Millimeter PMMA-Platten stapeln und unter einem Druck von fünf Kilogramm pro Quadratzentimeter in einem thermischen Bonder für 30 Minuten bei 110 Grad Celsius verkleben, um die Strömungs- oder elektrische Stimulationskanal-Baugruppe zu bilden. 12 Stück Adapter in Schicht eins der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber an den einzelnen Öffnungen kleben.
Desinfizieren Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate, das doppelseitige Band und das drei Millimeter optische PMMA mit ultravioletter Bestrahlung 30 Minuten lang, bevor Sie den Chip montieren. Verkleben Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate auf dem drei Millimeter optischen PMMA mit dem doppelseitigen Klebeband, um die PMMA-Baugruppe zu vervollständigen. Das gereinigte Deckglas mit dem beidseitigen Klebeband an der PMMA-Baugruppe kleben.
Versiegeln Sie die Öffnungen der Agar-Brückenadapter mit weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den flachen Bodenstecker über die mittleren Einlass- und Auslassadapter an die MOE-Chip-Baugruppe an, und schließen Sie dann den Kegel-Luer-Adapter an die Drei-Wege-Stoppcocks an. Fügen Sie zwei Milliliter 0,01%PLL-Lösung mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit dem Drei-Wege-Stopcock des Mediums Einlass verbunden ist, und schließen Sie eine leere Drei-Milliliter-Spritze an den Drei-Wege-Hahn des Medium-Auslasses.
Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung, und pumpen Sie die Beschichtungslösung langsam hin und her. Schließen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, der mit 5% Kohlendioxid-Atmosphäre gefüllt ist.
Öffnen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks und spülen Sie Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen. Zeichnen Sie drei Milliliter komplettes Medium in eine Drei-Milliliter-Spritze, die sich mit dem Drei-Wege-Stopphahn des Mediumeinlasses verbindet, und fügen Sie ihn hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Ersetzen Sie den weißen Finger-tight-Stecker durch den Luer-Adapter und injizieren Sie 3%heiße Agarose, um den Adapter zu füllen.
Schließen Sie die Luer-Sperrspritze an den Luer-Adapter an und injizieren Sie 3%heiße Agarose durch die schwarze Gummi-Bong, um die Luer-Sperrspritze zu füllen. 10 bis 20 Minuten für die Agarose abkühlen und erstarren lassen. Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren XYZ-Motorbühne bei 37 Grad Celsius befestigt ist.
Infundieren Sie die mNPCs, indem Sie den MOE-Chip manuell über den mittleren Auslass in den MOE-Chip pumpen, und dann den zellgesäten MOE-Chip auf der ITO-Heizung vier Stunden lang inkubieren. Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um quadratische Wellen-DC-Impulse auszugeben.
Entfernen Sie alle flachen Bodenstecker und Adapter auf dem MOE-Chip und füllen Sie die Adapter mit PBS, und versiegeln Sie dann die Adapteröffnungen mit Parafilm. Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Die DC-Pulsstimulation führte zu einer gleichzeitigen Unterscheidung von mNPCs in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten im Stammzellerhaltungsmedium.
Die Prozentsätze von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in der Kontrollgruppe und in der Stimulationsgruppe werden hier gezeigt. Nach der DC-Pulsbehandlung drückten die mNPCs signifikant hohe Anzahl von Neuronen bei DIV 7, Astrozyten an DIV 3 und Oligodendrozyten bei DIV 7 und DIV 14 waren in den Stimulationsgruppen relativ höher als in der Kontrollgruppe. Neurosphären, die durch 30 bis 40 Zellen gebildet werden, werden bevorzugt für die Initiierung der mNPC-Differenzierung.
Ein Überwuchern von mNPCs beeinträchtigt das Zellüberleben während des Differenzierungsprozesses.
