Diese Arbeit wird von der New York State Office of Science, Technology and Academic Research (NYSTAR) (in Form eines Center for Advanced Technology gewähren) und durch Zuschüsse aus dem Nanobiotechnologie Center (NBTC), eine STC-Programm der Nationalen unterstützt Science Foundation unter Vertrag Nr. ECS-9876771 und dem amerikanischen Brain Tumor Association und der New York Academy of Medicine (JAB).

Verfahren Coating Folien mit Fibronektin Vor der Montage der Mikrofluidikvorrichtung, sterilisieren Glasplättchen mit Fibronektin. Streichen Sie die Folien in einer biohood auf der Aufrechterhaltung der Sterilität. Richten Sie eine sterile PDMS spacer entlang der Ränder der Folie und markieren Sie die Seite, nach oben ist mit einem Permanent-Marker. 1 ml einer 5 mg / ml Lösung von Fibronektin (Sigma) im Inneren des PDMS spacer über die Gesamtheit der dem Glasträger. Lassen Sie die Dias ungestört für eine Stunde, dann vollständig trocknen mit einer N2-Pistole. Die Folien können bei 4 o C für spätere Experimente aufbewahrt werden. Zusammenbau des Geräts Die gesamte Vorrichtung Montage-Protokoll ist in einer biohood unter sterilen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung der folgenden Verfahren: <ol><li> Reinigen Sie die Silizium-Master mit den Mikrokanälen, die ihm durch Abwischen es mit 70% Ethanol und Trocknung mit dem N 2 Waffe gemustert. Legen Sie eine sterile PDMS spacer von 1 mm Höhe mit einer Pinzette in das Relief Features des Meisters. </li><li> Bereiten Sie das Agarosegel in das Gerät durch Wiegen 0,3 g Agarose-Pulver (Fisher Scientific) und 10 ml CO verwendet 2-unabhängigen Medien (Invitrogen) in einer 50 ml-Becherglas. Rühren Sie die Mischung mit einem Spatel und Hitze in der Mikrowelle für 20 Sekunden auf HIGH. Wenn ungelöste Granulat vorhanden sind, das Gemisch für weitere 10 Sekunden und wirbeln die heiße Mischung, um loszuwerden, die letzten verbliebenen Körner. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer Aufheizzeit von 8 Sekunden, und dann 5 Sekunden. </li><li> Schnell gießen Sie die Agarose-Lösung auf die Silizium-Master durch die PDMS spacer umgeben und sofort Deckung der Agarose-Gemisch mit einem sterilen Objektträger aus Glas. Tragen Sie einen konstanten, sanften Druck auf die Folie für ca. 2 Minuten, um sicherzustellen, dass die Agarose wird Gel auf die gleiche konstante 1 mm Höhe wie die PDMS spacer. </li><li> Nach dem Agarosegelen, Abziehen der gemusterten Agarosegel mit dem PDMS spacer aus dem Silizium-Master und den Transfer zu einem Fibronektin beschichteten Objektträger mit den Mikrokanälen im Agarosegel vor der Folie. Verwenden Sie eine 16-Gauge-Kanüle, um Löcher in das Reservoir Regionen der Mikrokanäle für Ein-und Auslass greift Punsch. Add 500 ul der CO 2-unabhängigen Medien, die gemusterten Agarosegel auf der Folie, um ein Austrocknen der Mikrokanäle zu verhindern. </li><li> Waschen Sie den Acryl-Verteiler in das Gerät mit 70% Ethanol verwendet und gründlich mit VE-Wasser. Richten Sie die Löcher in den Verteiler mit den Löchern in den Agarosegel mit den Mikrokanälen gestanzt. Dann richten Sie den Verteiler mit dem Gel, PDMS Spacer und das Fibronektin Folie mit dem Metallrahmen des Gerätes. Bringen Sie die Schrauben in das Gerät und ziehen Sie den Punkt des Widerstands mit einem Schraubendreher. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass das Gerät nicht, um das Ausmaß der Verformung der Mikrokanäle in die Agarose zu stark angezogen. Ziehen Sie die Schrauben im Uhrzeigersinn, um sicherzustellen, dass das Gel im Inneren des Gerätes nicht verschiebt. Testen Sie das Gerät auf Undichtigkeiten und Verstopfungen in den Mikrokanälen mit einem 1ml Spritze. Die Spritze ist mit Tygon-Schlauch mit einem Gel-loading Pipettenspitze am Ende des Rohres angebracht, um CO 2-unabhängigen Medien in den Mikrokanälen zu injizieren. Ein Mikrokanal ist erfolgreich gebildet, wenn Medien beobachtet wird, nur aus der Steckdose des Mikrokanals verlassen, wenn Medien in die entsprechenden Einlass injiziert wird. Jetzt ist das Gerät einsatzbereit. </li></ol> Vorbereitung und Aussaat der Zellen in das Gerät Wenn die Zellen 70% Konfluenz (Zelldichte etwa 100.000 Zellen / ml) zu erreichen, sind sie bereit, in das Gerät ausgesät werden. Vorbehaltlich der Zellen zu zwei DPBS (Invitrogen) wäscht. Geben Sie 200 ul von Trypsin-EDTA (Invitrogen), um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 5 ml M2 serumhaltigen, um das Trypsin zu inaktivieren. Zentrifugiert das Wachstum Medien mit den Zellen bei 1000 rpm für 5 Minuten. Abgesaugt Überstand und das Pellet von Zellen mit 5 ml DPBS. Zentrifugieren Sie die DPBS Zellen wieder unter den gleichen Bedingungen. Abgesaugt Überstand wieder, und das Pellet der Zelle in 500 ul der CO 2-unabhängige Medien. Seed resultierenden Suspension von Zellen in der Mitte Mikrokanal des Geräts über die Schwerkraft angetriebene Strömung. Fügen Sie die Ein-und Auslass des Zentrums Mikrokanal mit 60 ul der Zellsuspension und 20 ul CO 2-unabhängige Medium bzw.. Beachten Sie die Mitte Mikrokanal unter einem Hellfeld-Mikroskopie für die Zelladhäsion zu suchen. Die Zellen in der Regel nach 10 Minuten zu halten. Nachdem die Zellen, um den Kanal unten bei einer richtigen Dichte haften, pipettiert die restlichen Zellsuspension in den Einlass und den Medien in der Steckdose. Legen Sie 60 ul CO 2-unabhängigen Medien in beiden Ein-und Auslass des Center-Kanals. Legen Sie PDMS umfasst über the-Center Ein-und Auslass zu minimieren Verdunstung von Medien aus dem Center-Kanal. Imaging der Zellen in das Gerät Vor der Montage der Vorrichtung, Gewinde der sterile Schlauch-Schlauch durch die Wetterstation des Mikroskops (Olympus X81) und schließen mit der Schlauchpumpe (Watson-Marlow 205U/CA). Flush PBS durch den Schlauch mit einer Rate von 4 RPM. Nach der Montage des Gerätes, bereiten geeigneten Konzentrationen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (Sigma)-Lösungen in der CO 2-unabhängigen Medien in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Vortex die EGF-Lösungen für 5 Sekunden und schließen mit dem Schlauch. Verbinden Sie die Schläuche mit entsprechenden EGF-Konzentrationen auf das Gerät markiert. Es dauert etwa eine Stunde für den EGF über den Kanal Grat diffundieren und einen stetigen chemischen Gradienten. Ein Imaging-Software, Slidebook, wird verwendet, um eine Reihe von Bildern in alle 10 Minuten für ca. 5 Stunden in einem experimentellen Lauf zu nehmen. Die xy automatisierte Bühne ist so programmiert, dass zwei Teilbereiche (jeweils mit einer Fläche von 400μm x400μm) des gleichen Center-Kanal, und insgesamt drei Center-Kanäle zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet werden. Zellen in verschiedenen Center-Kanäle (in der Regel 3 in einem Lauf) haben unterschiedliche EGF-Konzentrationen, wie auf dem Schlauch markiert. Materialien und Geräte Zelllinien: C17.2 Zellen NSCs aus dem externen Keimblattes der postnatalen Kleinhirn der Maus 6, 7 abgeleitet. Mit Hilfe dieser Zelllinie, haben wir zwei andere Mäuse-Stammzellen-Linien mit Retrovirus Transfektion Methode entwickelt. Diese beiden stabil transfizierter Zelllinien sind (1) wtEGFR -, dass über-Ausdruck der menschlichen Wildtyp-EGFR, und (2) ΔEGFR - das ist eine konstitutiv aktive EGFR-Mutante. Zur Erleichterung der Erkennung führen Retroviren ein Rückgrat mit dem Gen von Interesse durch eine interne Website für ribosomalen Bindungsstellen (IRES) und dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) gefolgt. Zellkultur: Die Maus C17.2 NSCs und deren Varianten wurden in einer 6-Well-Platte in M2-Medium (DMEM (Invitrogen) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Invitrogen), 5% Pferdeserum (HS) (Invitrogen gewachsen ) und 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen).) Zellen wurden bei 37 o C in 80% Luft und 5% CO 2 gehalten. Mikrofluidik-Gerät: Ein Kunststoff-Verteiler, ein PDMS spacer und einem Edelstahl-Rahmen zur Aufnahme des Gerätes in Kraft. Imaging Eine invertierte Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX-81) verwendet wird, in Verbindung mit einer intensivierten CCD-Kamera (Orca, Hamamatsu). Die mikrofluidischen Gerät basiert auf einer automatisierten xyz Bühne montiert, und die Bühne wird von einer Klimakammer, die eine Temperatur von 37 o C. unterhält eingeschlossen Es gibt in der Regel 3-4 Geräte auf dem gleichen Chip, die zur gleichen Zeitpunkt mit dem automatisierten xyz Bühne gefilmt werden. Flow-Pflege Eine peristaltische Pumpe mit 8 parallelen Linien (Watson-Marlow 205U/CA) auto wird verwendet, um Strömungen in allen Sink-und Source-Kanäle zu erhalten. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Abbildung 1" width="573" height="414" /> Abb.. 1 Motilität von drei NSC-Stämme (Eltern, wtEGFR und D EGFR) in verschiedenen Konzentrationen EGF Alle Bahnen sind von der Verfolgung einen Film von 5 Stunden (mit Ausnahme von wtEGF 100ng/ml, 4 Stunden) genommen, und der Ursprung aller Tracks wurden neu auf (0,0) zu Vergleichszwecken. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Abbildung 2" width="576" height="546" /> Abb.. 2 Korrelation von EGFR Expression und Motilität (a) zwei Bilder wtEGF NSCs auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanal mit 100ng/ml EGF. Das linke Bild ist ein Fluoreszenzbild und das Recht ist eine Übertragung Hellfeldbild. Der Maßstab ist 100 um, und die Kanalbreite 400 um. Die Zellen werden in zwei Populationen von der Helligkeit der GFP zum Ausdruck getrennt. Cells in den blauen Kreisen Dimmer sind, haben somit weniger EGFR-Expression Ebene; und Zellen in roten Kreise sind brigher, haben also höhere EGFR-Expression auf. (B) Trajektorien von Zellen mit niedriger und hoher EGFR-Expression auf. Diese Bahnen sind von einem 4 Stunden langen Film übernommen.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

Abb.. 1 zeigt Trajektorien von drei NSC-Stämme, die elterliche Zellen, die wtEGFR und die ΔEGFR (Kontrolle). Jeder Satz von Trajektorien wurden aus einer 5 Stunden langen Film erhalten. Für Eltern Zellen, erreichte Zellbewegung bei EGF-Konzentration betrug ~ 10ng/ml; für wtEGFR Zellen verschoben Zellmotilität Spitze 100ng/ml oder höher; für ΔEGFR Zellen wurde die Zellbewegung unabhängig von EGF-Konzentration wie erwartet. Die wtEGF Zellen mit 100ng/ml waren die beweglichen Zellen, zogen sie etwa 1,5 mal schneller als der el...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

Während Mikrofluidik-Technologie erreicht einen neuen Grad der Reife für makromolekulare Assays sind zell-basierte Assays noch in den Kinderschuhen Stufe 1. Dies ist vor allem wegen der Schwierigkeit, mit denen man eine Zelle-kompatibel und stabil Mikroumgebung mit herkömmlichen Mikrofabrikation Techniken und Materialien zu erstellen. Wir lösen dieses Problem durch die Einführung eines neuartige Mikro-Material, Agarosegel, als Basismaterial für die Mikrofluidik-Gerät. Agarose-Gel ist sehr formbar und gas-und Nährstoffe, die für das Überleben der Zelle und somit ein ideales Material für zell-basierte Assays. Wir haben früher die Agarosegel-basierte Geräte wurden bei der Untersuchung von Bakterien und neutrophilen Zellwanderung 2 erfolgreichen gezeigt. In diesem Bericht werden drei parallel mikrofluidischen Kanälen in einem Agarosegel Membran von etwa 1 mm Dicke gemustert. Constant fließt mit Medien / Puffer sind in den beiden seitlichen Kanälen mittels einer peristaltischen Pumpe aufrechterhalten. Die Zellen werden in den Center-Kanal für die Beobachtung gehalten. Da die Nährstoffe und Chemikalien in die Seitenkanäle ständig diffundieren von der Seite zu Center-Kanal, die chemische Umgebung des Center-Kanals sind, ist leicht über die Strömung entlang der seitlichen Kanälen gesteuert. Mit diesem Gerät zeigen wir, dass die Bewegung der neuralen Stammzellen optisch kann mit Leichtigkeit unter verschiedenen chemischen Bedingungen überwacht werden, und die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen erhöht. Motilität von neuralen Stammzellen ist ein wichtiger Biomarker für die Beurteilung der Zellen Aggressivität, damit tumorigenen Faktor 3. Die Entschlüsselung der zugrunde liegende Mechanismus NSC Beweglichkeit erhalten einen Einblick in beide Störungen der neuronalen Entwicklung und in Hirntumoren Stammzellen Invasion ergeben.

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Aufrufe.  Cornell University. Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Serie: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Forschung

Biologie

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Counting Nervenstammzellen

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Non-Plasma-Bonding von PDMS für preiswerte Herstellung von Mikrofluidik-Geräte

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.