Unser Protokoll ermöglicht eine effiziente Identifizierung von Gen- oder Genkombinationen, die die Krebsinvasion im Viewer blockieren. Überkultur erfordert keine fortschrittlichen Tiereinrichtungen für die Wartung. Insgesamt können generische oder allgemeine Spezialbibliotheken innerhalb weniger Wochen im Viewer gescreent werden.
Dieses Over-Screening-System wird Forschern helfen, neuartige therapeutische Genziele oder Genzielkombinationen zu entdecken, mit denen Krebsmetastasen blockiert werden können. Konzentrieren Sie die Zellen für die intravenöse Injektion auf 0,5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter, wobei Sie eiskaltes 1X PBS verwenden, um die Zellen zu verdünnen oder erneut zu suspendieren. Erwarten Sie, dass etwa ein Milliliter Zellsuspension pro 10 Embryonen benötigt wird.
Um die Injektionsvorrichtung zusammenzubauen, montieren Sie eine Nadel auf die Spritze und verlängern Sie dann die Spritzennadel mit einem drei bis fünf Zentimeter langen Stück Schlauch. Brechen Sie die Spitze der Borosilikatnadel mit einer feinen Handzette. Laden Sie die Spritze mit 50 bis 200 Mikrolitern der Krebszellsuspension.
Und führen Sie die Borosilikatnadel in den Schlauch ein. Untersuchen Sie die Nadel auf Zellverstopfungen und Luftblasen. Wenn eine Zellverstopfung innerhalb der Kapillare beobachtet wird, entfernen Sie die Kapillare, suspendieren Sie die Zellen erneut und ersetzen Sie sie durch eine neue Kapillare.
Verwenden Sie den Kolben, um Blasen herauszudrücken. Entfernen Sie den Deckel und übertragen Sie den Embryo unter das Stereoskop. Identifizieren Sie die geeignete Vene, die auf der CAM-Oberfläche injiziert werden soll, die normalerweise nur geringfügig breiter als der Durchmesser der Borosilikatnadelspitze ist und sich in der Mitte zwischen dem Embryo und der Wiegeschalenwand befindet.
Es ist im Allgemeinen einfacher, an der Stelle zu injizieren, die unmittelbar an die Venenverzweigung angrenzt. Drücken Sie die Nadelspitze gegen die Blutgefäßwand und drücken Sie sanften Druck in die gleiche Richtung wie der Blutfluss aus. Verwenden Sie bei Bedarf einen Wattestäbchen, um das injizierte Gefäß zu verankern oder zu stabilisieren.
Drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig für 2 bis 10 Sekunden, bis das gewünschte Volumen injiziert ist. Entsorgen Sie den Embryo, wenn an der Injektionsstelle übermäßige Blutungen oder klare Flüssigkeitsansammlungen auftreten. Entfernen Sie die Nadel aus dem CAM und tupfen Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen ab, um Blut oder überschüssige Krebszellen zu entfernen.
Decken Sie den injizierten Embryo in der Wiegeschale mit dem Deckel ab und bringen Sie ihn in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Embryonen injiziert sind. Untersuchen Sie die Embryonen visuell auf Bakterien oder Schimmelpilzkontamination oder Tod.
Und entsorgen Sie kontaminierte Embryonen gemäß laborentsorgten Verfahren. Stellen Sie sicher, dass metastasierende Kolonien in den ersten ein bis drei Tagen nach der Injektion einheitlich erscheinen. Und identifizieren Sie invasive oder nichtinvasive metastatische Kolonien an den Tagen vier bis fünf nach der Injektion.
Entfernen Sie am fünften Tag nach der Injektion die Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen und lokalisieren Sie die EMBRYO-CAMs auf metastatische Kolonieverteilung. Ziehen Sie unter dem Dissektionsmikroskop das CAM-Gewebe, das die metastasierende Kolonie von Interesse enthält, vorsichtig mit einer feinen Handzette nach oben und schneiden Sie es mit einer chirurgischen Schere ab. Das CAM-Gewebe in ein leeres, steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und den Röhrchendeckel schließen.
Wiederholen Sie den Exzisionsprozess, bis alle interessierenden Kolonien in separaten Röhrchen gesammelt sind. Zerhacken Sie das CAM-Gewebe vorsichtig in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer separaten sterilen 18-Gauge-Nadel für jede Kolonie. Fügen Sie 100 Mikroliter 1X Kollagen-A-Lösung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Drehen Sie die Zellen und das CAM-Gewebe bei 300 mal G für fünf Minuten bei Umgebungstemperatur herunter. Saugen Sie die Kollagen-A-Lösung an und suspendieren Sie die Zellen unvollständige Medien für die Zelllinie von Interesse. Dann drehen Sie die Zellen und das Gewebe erneut.
Suspendieren Sie Zellen und Gewebestücke in einem Milliliter des vollständigen Mediums und Selektionsfaktors, falls vorhanden. Dann in eine einzige 12-Well-Gewebekulturschale gut überführen. Überwachen Sie die Krebszellen in den nächsten ein bis drei Wochen täglich auf Wachstum und Kontamination.
Wenn die Zellen 70 bis 80% der Konfluenz erreichen, werden sie in eine kulturstärkere Schale überführen. Fahren Sie mit der Sequenzierung oder der nächsten Selektionsrunde fort, sobald ausreichende Krebszellenzahlen erreicht sind. Embryonen, die aufgrund einer erfolglosen Injektion eine Ansammlung von Krebszellen aufweisen, können in den meisten Kapillaren beobachtet werden.
Wenn die optimale Zellkonzentration und -dauer erreicht ist, sollten die transduzierten Zellen am fünften Tag nach der Injektion eine Vielzahl von Koloniephänotypen produzieren, wobei die Mehrheit der Kolonien invasiv ist, wie durch die Krebszellen bestimmt, die im CAM-Gewebe verstreut erscheinen. Es sollte auf die metastasierten Kolonien geachtet werden, die kompakt erscheinen und weit genug von benachbarten Kolonien entfernt sind, dass sie mit Einer Zette und Schere und einem Stück CAM-Gewebe herausgeschnitten werden können. Ein isolierter positiver Bildschirmtreffer sollte bei erneuter Injektion den kompakten Koloniephänotyp anzeigen.
Bei der Messung der Blutgefäßkontakte der Krebszellen sollte auf die Helligkeit der Gefäßwandflecken geachtet und die entsprechende Menge an Lektinen für das Gefäßwandsignal injiziert werden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, vermeiden Sie unter oder über Injektion und entfernen Sie übermäßige Blutungen oder Flüssigkeitsansammlungen. Mehrere neuartige Gene, die die Invasion von Krebszellen beim Betrachter vorantreiben, wurden mit dieser Technik identifiziert.
