Dieses Protokoll ermöglicht die Bildung von metastasierenden Tumorzellen des Gehirns und die Erzeugung von Ex-vivo-Gehirnschnitten, die ein schnelles Testen der Arzneimittelwirksamkeit und Bestrahlung auf einen vorgeformten Tumor ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, mehrere Medikamente oder Behandlungen in einer physiologisch relevanten Umgebung, die die Gehirn-Tumor-Wirt-Interaktionen aufrechterhält, schnell zu testen. Diese Methode kann helfen zu verstehen, wie metastasierende Gehirnzellen wachsen, überleben und in das Gehirnparenchym eindringen, und die Rolle der Mikroumgebung des Hirntumors beim Wachstum und der Ausbreitung von Krebs zu verstehen.
Das Verfahren wird von Lorela Ciraku und Emily Esquea, beide Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die betäubten Mäuse in einen stereotaktischen Rahmen und immobilisieren Sie den Kopf mit Standard-Ohrstangen. Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes dreimal durch wiederholtes abwechselndes Auftragen von Jodabstrichen und 70% Ethanol vor dem Einschnitt.
Machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen Einschnitt von einem Zentimeter in der Mittellinie in einem diagonalen Winkel zur imaginären Achse, der das Gehirn der Mäuse in zwei symmetrische Hälften teilt, um den Schädel freizulegen. Nachdem Sie das Blut mit einem Wattestäbchen abgewischt haben, lenken Sie die Haut seitlich ab, um die Injektionsstelle freizulegen. Verwenden Sie einen 0,73 Millimeter Gratbohrer, um den Schädel zu durchdringen, und bohren Sie ein Loch mit leichtem Druck und Drehbewegung.
Um fünf Mikroliter Zellen zu injizieren, die GFP-Luciferase stabil exprimieren, führen Sie eine hochpräzise Spritze bis zu einer Tiefe von 3,5 Millimetern in das Gehirn ein. Lassen Sie es für zwei Minuten absetzen und ziehen Sie dann die Spritze etwa einen Millimeter nach oben. Injizieren Sie nach zwei Minuten langsam das erste halbe Volumen und warten Sie weitere zwei Minuten, bevor Sie den Rest des Volumens injizieren.
Ziehen Sie nach drei Minuten langsam an der Spritze. Tragen Sie Knochenwachs auf die Injektionsstelle am Schädel auf und nähen Sie das Gewebe mit Polypropylennähten. Überwachen Sie das Verhalten der Maus direkt nach der Operation regelmäßig, um festzustellen, ob eine spezielle Behandlung, einschließlich Kochsalzinjektion und weicher Nahrung, erforderlich ist, um eine schnelle Genesung zu unterstützen.
Um das Tumorwachstum mittels Biolumineszenz-Imaging zu überwachen, schalten Sie zuerst den Sauerstoff und das Isofluran auf dem Bildgebungssystem ein und lassen Sie beide auf die separate Kammer außerhalb der Bildgebungsbox verteilen. Wählen Sie dann, nachdem Sie die Software eingeschaltet und das Instrument initialisiert haben, die entsprechende Option zum Visualisieren und Erfassen des gesamten Mauskörpers. Als nächstes bringen Sie die Mäuse in die Kammer außerhalb der Bildgebungsbox, die mit Sauerstoff und Isofluran versorgt wird.
Sobald die Mäuse unter der narkosetischen Wirkung sind, injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 200 Mikroliter von 30 Milligramm pro Milliliter Luciferin. Legen Sie die Mäuse in die Bildgebungskammer mit dem Magen nach unten zur Nasenlippe der Bildgebungskammer. Verriegeln Sie die Kammer, wählen Sie zwei Minuten Zeitbelichtung, um die Bildgebung zu starten, und schließen Sie dann die Bildgebung ab.
Nachdem Sie den Tissue-Slicer in eine sterile Laminar-Flow-Haube gelegt haben, reinigen Sie alle Werkzeuge und Instrumente mit 70% Ethanol. Nach dem Einschläfern der Maus entfernen und legen Sie das Gehirn schnell in eiskalte Saccharose-ACSF-Lösung. Übertragen Sie das Gehirn mit einem Spatel auf ein ACSF-benetztes Filterpapier auf einem 60-Millimeter-Tellerdeckel.
Schneiden Sie mit einer scharfen, sterilen Rasierklinge die überschüssigen Teile des Gehirns, die keinen Tumor enthalten, einschließlich des unteren Teils des Gehirns, ab, um die Form des Gehirns in einen nicht perfekten Würfel zu bringen. Nachdem Sie mehrere Blätter ACSF-benetztes Filterpapier auf die Schneideplattform gelegt haben, legen Sie das verstopfte Gewebe auf das Filterpapier. Um das Gewebe in 200 bis 250 Mikrometer dicke Abschnitte zu schneiden, stellen Sie die Schnittgröße auf 2 oder 2,5 Einheiten auf dem Anbieterlineal ein und beginnen Sie mit dem Schneiden.
Verwenden Sie einen Pinsel, um Gehirnscheiben in eine Schale mit Saccharose-ACSF zu übertragen und die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 27-Gauge-Nadeln zu trennen. Identifizieren Sie die GFP-positiven Schnitte unter dem fluoreszierenden Mikroskop. Übertragen Sie dann mit einer sterilen Ein-Milliliter-abgebrochenen Pipette mit einer breiten Öffnung die identifizierten Scheiben in eine neue 60-Millimeter-Schale, die zwei bis drei Milliliter erwachsene Scheibenmedien enthält.
Übertragen Sie dann drei bis fünf Scheiben auf jede Gewebekultureinlage in jeder Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen in sicherer Entfernung. Nachdem Sie das überschüssige Medium von der Oberfläche des Einsatzes entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter ausgleichendes erwachsenes Mausschnittmedium unter jede Einlage hinzu. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Feuchtigkeit für 24 Stunden vor der Bildgebung.
Pipettieren Sie fünf Mikroliter von 30 Milligramm pro Milliliter Luciferinlösung in das Medium unter den Einsätzen in einer sterilen Haube. Platzieren Sie die Sechs-Well-Platte mit dem Deckel in der Abbildungskammer des Instruments unter der stationären Kamera und verriegeln Sie die Kammertür. Öffnen Sie die Software und initialisieren Sie das Instrument.
Nachdem Sie die Kameraeinstellungen ausgewählt haben, die die Visualisierung und Aufnahme von nur einem Well pro Bild ermöglichen, platzieren Sie den zu bebildernden Well direkt unter der Kamera. Verwenden Sie das ROI-Tool, passen Sie es an die Tumorform und -größe an, messen Sie den ROI und melden Sie die Gesamtmesswerte, um das biolumineszierende Signal jedes Tumors auf der Scheibe zu quantifizieren. Nachdem Sie die Platte wieder auf die sterile Laminar-Flow-Haube gebracht haben, verwenden Sie eine Pinzette, um den Einsatz leicht aus dem Brunnen zu heben.
Nachdem Sie das Medium abgesaugt haben, ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter frisches Medium und legen Sie den Einschub wieder in die Vertiefung. Für die Experimente, bei denen die Scheiben mit verschiedenen Verbindungen wie Inhibitoren und Metaboliten behandelt werden, bereiten Sie die entsprechende Reagenzienkonzentration in 1,2 Millilitern Gehirnschnittmedien in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vor und übertragen dann einen Milliliter Reagenz in die Vertiefung, die die Scheibe enthält. Die MDA-MB-231 BR-GFP-Luciferase-Zellen wurden in nackte Mäuse injiziert, Tumore durften wachsen, Gehirne mit Tumoren wurden seziert, geschnitten, ex vivo gezüchtet und das Tumorwachstum wurde durch Biolumineszenzbildgebung überwacht.
Die H & E-Färbung und die GFP-positive Fluoreszenz bestätigten das Vorhandensein eines Tumors in der Gehirnscheibe. Die erhöhte Ki-67-Färbung bestätigte das Vorhandensein von stark proliferativen Krebszellen. Die Tumoren in Hirnschnitten, die keiner Bestrahlung ausgesetzt waren, wuchsen ex vivo weiter, während Tumore, die einer Bestrahlung ausgesetzt waren, ein stockendes Wachstum aufwiesen.
Gehirnschnitte, die Tumore enthielten, wurden auch mittels Live-Bildgebung überwacht, um das Tumorwachstum nach der Bestrahlung zu visualisieren. In Übereinstimmung mit der biolumineszenten Bildgebung wuchsen die Kontrollkrebszellen schnell, als die GFP-Intensität zunahm und die Zellen begannen, in das Gehirnparenchym einzudringen. Im Gegensatz dazu waren die Krebszellen in Gehirnschnitten, die mit Bestrahlung behandelt wurden, zytostatisch und die GFP-Intensität wurde beibehalten.
Große mehrkernige Krebszellen und eine Zunahme der Färbung von DNA-Schadensmarkern in IR-behandelten Krebszellen wurden nachgewiesen. Auch eine Zunahme reaktiver Astrozyten wurde nachgewiesen. Die IR-behandlungsinduzierte Apoptose wurde in den tumorfreien Hirnschnitten der Maus nicht nachgewiesen.
Die Gehirnschnitte, die Tumore enthielten, wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Paclitaxel, einem Chemotherapeutikum, behandelt. Die Behandlung verringerte die Größe des Tumors signifikant nach Tag 10 der Behandlung. Ein Anstieg der Apoptose wurde in mit Paclitaxel behandelten Tumorzellen festgestellt.
Die Behandlung mit dem Inhibitor veränderte die Lebensfähigkeit des Gehirngewebes nicht. Kein Anstieg der Apoptose wurde durch gespaltene Caspase-3-Färbung in Paclitaxel-behandeltem tumorfreien Maus-Gehirnschnitt gemessen. Wenn die Behandlung mit den interessierenden Medikamenten beendet ist, können Scheiben durch Immunzytochemie, omische Studien oder Einzelzellsuspension, die für die Durchflusszytometrie geeignet ist, auf Proteinexpression analysiert werden.
