Dieses Protokoll kann verwendet werden, um arrayed lentivirale oder retrovirale Assay-Bibliotheken zu überprüfen, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell, mittlerer Durchsatz und kostengünstig ist und geräte und Reagenzien verwendet, die für die meisten Forscher allgemein zugänglich sind. Um jeden lentiviralen Vektor in der Bibliothek zu erweitern und zu reinigen, fügen Sie zunächst 1,3 Milliliter Luria-Brühe hinzu, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in jeden Brunnen einer 96-Well-Tiefenbrunnenplatte.
Impfen Sie jeden Brunnen mit zwei Mikroliter Glyzerin-Lager für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie am nächsten Tag jede Bakterienkultur in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren zur Zentrifugation. Reinigen Sie jeden Vektor mit einem geeigneten bakteriellen Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Für jeden Vektor in der vorbereiteten Bibliothek einen Brunnen einer 24-Well-Platte mit einem mal 10 bis fünften 293FT-Zellen säen und die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Um ein Transfektionsgemisch vorzubereiten, das für jeden Vektor in der Bibliothek eingerichtet wird, wird zunächst jeder lentivirale Vektor zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser deute. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung in einzelne Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.
Machen Sie eine Transfektion Super-Mix durch Mischen 1,25 Mikroliter mal x Transfektion Reagenz eins mit 23,75 Mikroliter mal x vorgewärmten Transfektionpuffer. Inkubieren Sie die Transfektion Super-Mix bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann fügen Sie 125 Nanogramm mal x psPAX2 und 125 Nanogramm mal x VSVG in den Supermix mit sanfter Pipettierung.
Sofort aliquot die Super-Mix in jede Röhre eines PCR-Streifen und verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 25 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen des verdünnten viralen Vektor zu übertragen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit einer Mehrkanalpipette 30 Mikroliter jedes Transfektionsgemisches aus jedem Brunnen in einen entsprechenden Brunnen von 293FT-Zellen in der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden, bevor Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 Mikroliter frisches komplettes Wachstumsmedium für eine weitere 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator ersetzen.
Verwenden Sie am nächsten Tag eine Mehrkanalpipette, um den viralen Überstand aus jedem Brunnen zu sammeln und 220 Mikroliter jedes Überstands in zwei Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte zu sammeln, um eine angeordnete virale Überstandplatte zu erzeugen. Um A375-Zellen auf eine Infektion vorzubereiten, samen Sie einmal 10 bis fünf Zellen in einer 24-Well-Platte in 0,5 Milliliter vollständigem Wachstumsmedium pro Brunnen für jeden viralen Vektor in der Bibliothek. Fügen Sie einen zusätzlichen Brunnen, der nicht infiziert werden, um als Kontrolle für die Medikamentenauswahl dienen.
Nach einer 24-stündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator tauen Sie den gefrorenen, auf Raumtemperatur eingestellten lentierten Lentiviral-Überflieger auf, bevor das Wachstumsmedium aus jedem Brunnen der vorbereiteten Zellkulturplatte durch 200 Mikroliter Wachstumsmedium ersetzt wird, ergänzt um 20 Mikrogramm pro Milliliter Polybren. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter viralen Überstand von jedem 96-Brunnen auf jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Geben Sie die Zellen für 24 bis 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.
Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen mit 500 Mikroliter Wachstumsmedium mit Puromycin ergänzt und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator für weitere 48 Stunden zurück. Nach der 48-stündigen Puromycin-Auswahl sortieren Sie die Zellen in drei oder vier Gruppen, so dass alle Brunnen in einer einzigen Gruppe eine ähnliche Zelldichte haben, und fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin-EDTA zu einem repräsentativen Gut aus jeder Gruppe für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu. Sobald sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 400 Mikroliter Wachstumsmedium mit Puromycin ergänzt und zählen die Anzahl der Zellen aus jedem Trypsinized gut.
Verdünnen Sie jede Zellsuspension auf eine zwei mal 10 bis die fünfte Zelle pro Milliliter Konzentration mit Wachstumsmedium mit Puromycin und Samen 500 Mikroliter Zellen aus jedem Brunnen in die gleiche Brunnenposition in einer neuen 24-Well-Platte ergänzt. Nach der Verwendung der Zählungen aus jedem repräsentativen Brunnen, um die Zellzahl in jedem verbleibenden Brunnen in jeder Gruppe zu schätzen, fügen Sie das entsprechende Volumen von Trypsin-EDTA zu jedem Brunnen hinzu, um eine ein mal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration zu erreichen. Verwenden Sie während der Trypsinisierung eine Mehrkanalpipette, um 400 Mikroliter Wachstumsmedium, ergänzt mit Puromycin, in die entsprechenden brunnen in der neuen 24-Well-Platte hinzuzufügen.
Sobald sich die Zellen gelöst haben, mischen Sie vorsichtig den Inhalt jedes Brunnens und übertragen Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension in den entsprechenden Korbrunnen in der neuen 24-Well-Platte. Dann kehren Sie die Zellen für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Um die Zellen mit den Dual-Luciferase-Reporterkonstrukten zu transfekieren, bereiten Sie die in der Tabelle angegebene Transfektionsverdünnungsmischung vor.
Um die Verdünnungsmischung des Reporters vorzubereiten, mischen Sie die Volumina jedes Reagenzes multipliziert mit der Gesamtzahl der Transfektionen plus mehreren zusätzlichen Volumina. Als nächstes mischen Sie die Transfektionsverdünnungsmischung mit dem Reporter-Verdünnungsgemisch und inkubieren Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um die Transfektionsmischung zu produzieren. Während der Inkubation spülen Sie jeden Brunnen der Zellkulturplatte mit 250 Mikroliter PBS ab und fügen Sie jedem Brunnen 447 Mikroliter frisches komplettes Wachstumsmedium hinzu.
Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 53 Mikroliter Transfektionsmischung auf jeden Brunnen der Zellkulturplatte zu verteilen. Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Um die Luziferaseaktivität zu messen, verdünnen Sie den 5X passiven Lysepuffer aus dem Luziferase-Aktivitätskit bei einer Ein-zu-Fünf-Verdünnung mit entionisiertem Wasser und tauen Sie die notwendigen Volumina von Reagenz A und Reagenz B-Puffer aus dem Kit auf.
Wenn die Reagenzien fertig sind, ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen durch 75 Mikroliter passiver Lysepuffer und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln. Während der Inkubation das 50-fache Reagenz-B-Substrat aus dem Kit auf eine Ein-50-Konzentration mit aufgetautem Reagenz-B-Puffer verdünnen. Am Ende der Inkubation 30 Mikroliter passiver Lysepuffer zu vier leeren Kontrollbrunnen hinzufügen und 30 Mikroliter Lysat aus jedem Brunnen in doppelte Brunnen einer 96-well flachen weißen Arschplatte übertragen.
Wenn das gesamte Lysat plattiert ist, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Reagenz A zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Firefly-Luzifferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Reagenz B zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Renilla-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Wie erwartet, YAP2SA erhöht Galleifeaktivität Aktivität, aber nicht Renilla Luziferase Aktivität im Vergleich zum Kontrollvektor.
Im Gegensatz dazu erhöht YAP2SA S94A die Aktivität der Galleifeferase nicht. Wichtig ist, dass YAP2SA die Aktivität eines minimalen Promotorkonstrukts, dem die MCAT TEAD-Bindungselemente fehlen, nicht ändert. In Zellen, die mit dem YAP-TAZ-TEAD-Reporterkonstrukt transfiziert wurden, reduzierten die Tandem-Kurzhaarnadeln YAP und TAZ die Guplifly-Luziferase-Spiegel signifikant, die Kontrolle der kurzhaarigen Nicht-Targeting-Kontrolle jedoch nicht.
Im Gegensatz dazu verändert die YAP-TAZ Kurzhaarnadel-RNA in Zellen, die mit dem minimalen Reporterkonstrukt transfiziert sind, den Galleifuifasespiegel nicht signifikant. Das Renilla-Signal in jedem Brunnen wird auch nicht signifikant durch die kurze Haarnadel-Nicht-Targeting-Kontrolle oder die YAP-TAZ-Kurzhaarnadel-RNA verändert. Wie erwartet reduzieren kurze Haarnadel-RNAs, die auf YAP und TAZ, SARC oder PI3-Kinase abzielen, die YAP-TAZ-TEAD-Aktivität erheblich.
Kurze Haarnadel RNAs für ATM, CDH1, CSK, ERBB2, und Gelsolin jeweils erhöhte normalisierte Glühwürmchen Luziferase Spiegel im Einklang mit veröffentlichten Studien, die zeigen, dass diese Proteine YAP und /oder TAZ waren. Trotz etablierter Rollen für ATR, CCNE2 und ERBB4 in anderen Zelltypen, kurze Haarnadel-RNAs, die auf diese Gene abzielen, verändern nicht signifikant normalisierte Gob-Luziferase-Spiegel in A375-Zellen. Im Anschluss an diesen Bildschirm sollten die Identifizierungsregulatoren anhand anderer Auslesungen für ihre Transkriptionsfaktoraktivität validiert werden.
Der effektive Abbau des identifizierten Reglers durch den Test sollte ebenfalls bestätigt werden. Denken Sie daran, Vorsicht walten zu lassen und Sicherheitsrichtlinien zu befolgen, wenn Sie mit infektiösen Lentiviren arbeiten, insbesondere wenn die Viren infektiös sind.
