Es ist schwierig, die Sarkomerfunktion in den pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten aufgrund ihres unterentwickelten und unorganisierten Sarkomes zu beurteilen. Mit fluoreszierenden Sarkomerproteinen können wir jetzt auf die Sarkomerverkürzung zugreifen. Wir können Sarkomere visualisieren und ihre Funktion in vitro mit Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten und fluoreszierenden Sarkomerproteinen beurteilen.
Mit Hilfe der AAV-basierten Transduktion können wir die Methode auf alle vom Patienten abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzellen ausweiten. Diese Methode kann auf die Entwicklung der Kardiomyopathie-Therapie ausgeweitet werden, da sie zur direkten Beurteilung der krankheitsbedingten Sarkomer-Dysfunktion in vitro verwendet werden kann. Diese Methode ist nützlich im Bereich der Kardiologie, einschließlich der pädiatrischen Kardiologiestudie.
Es kann jedoch auch auf die Untersuchung von Skelettmuskelfunktionsstörungen wie Myopathie angewendet werden. Am vierten Tag der Differenzierungsinduktion beschichten Sie eine Sechs-Well-Platte mit 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter Laminin-511 E8, verdünnt in PBS für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Gegen Ende der Inkubation behandeln Sie die vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit rekombinantem Trypsin.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, ernten Sie Zellen zu Medium, ergänzt mit 10% FBS zum Zählen, und resuspendieren Sie die Zellen bei einem 1,25 mal 10 bis den fünften Zellen pro zwei Milliliter AK02N Medium, ergänzt mit Laminin-511 E8 und ROCK-Inhibitor nach der Zentrifugation. Als nächstes saugen Sie die Beschichtungslösung aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte an und säen Zwei Milliliter Zellen in jede Vertiefung. Bringen Sie die Platte in den Zellkulturinkubator zurück.
Nach vier Tagen erreichen die Zellen eine Konfluenz von 80%. Ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter RPMI plus B27 ohne Insulinmedium, das mit GSK-3-Inhibitor pro Vertiefung ergänzt wird, um die Differenzierung zu induzieren. Ersetzen Sie das Medium nach zwei Tagen der Differenzierung vorsichtig durch zwei Milliliter RPMI plus B27 ohne Insulinmedium, das mit Stachelschweinhemmer pro Vertiefung ergänzt wird.
Die Zellen sollten eine 100%ige Konfluenz erreicht haben. Ersetzen Sie am vierten Tag der Differenzierung die Überstände vorsichtig durch zwei Milliliter RPMI plus B27 ohne Insulin pro Vertiefung. Die Zellen sollten in einer hohen Dichte bleiben, und einige könnten begonnen haben zu schweben.
Ersetzen Sie am siebten und neunten Tag der Differenzierung den Überstand in jedem Bohrplatz durch zwei Milliliter RPMI plus B27 durch Insulin, das mit Puromycin für eine selektive pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozytenkultur ergänzt wird. An diesem Punkt sollten schlagende Zellen in den Kulturen beobachtet werden. Um eine gemusterte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozytenkultur einzurichten, verwenden Sie zunächst Einwegband, um Staub von der Oberfläche eines maßgeschneiderten PDMS-Stempels zu entfernen, und tauchen Sie den Stempel kurz in 70% Ethanol.
Verwenden Sie einen Luftstaubsauger, um das Ethanol von der Stempeloberfläche zu entfernen, und behandeln Sie die Oberfläche mit fünf bis 10 Mikrolitern 0,5% MPC-Polymer und Ethanol. Wenn das Polymer vollständig getrocknet ist, legen Sie den Stempel auf einen Polymerdeckel in einer 35-Millimeter-Bildschale und legen Sie ein Gewicht auf den Stempel. Verwenden Sie nach 10 Minuten ein Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass das Muster auf den Abdecklappen übertragen wurde, und waschen Sie die Schüssel und den Abdecklappen zweimal mit PBS.
Nach der zweiten Wäsche den Deckmantel mit 0,5 bis einem Mikrogramm pro Quadratzentimeter Laminin-511 E8 verdünnt in 0,1% Gelatine für eine zwei- bis vierstündige Inkubation bei Raumtemperatur beschichten. Am Tag 10 der Differenzierung waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, gefolgt von einer Behandlung mit einem Milliliter rekombinantem Trypsin pro Vertiefung für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Zählen die Zellen mit 2,5 bis fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter RPMI plus B27 mit Insulin, das mit Puromycinkonzentration ergänzt wird, resuspendieren und einen Milliliter Zellen auf die Platte säen, um sie über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren.
Ersetzen Sie am nächsten Morgen den Überstand durch frisches RPMI plus B27 durch Insulin, das mit Puromycin ergänzt wird, und bringen Sie die Zellen in den Zellkulturinkubator zurück, wobei das Medium zwei- bis dreimal pro Woche bis zum 21. bis 28. Tag für die Bildgebung aufgefrischt wird. Für die Zeitraffer-Bildgebung der Sarkomerverkürzung in den PCCSM-Kulturen tragen Sie Öl auf die 100-fach objektive Linse eines fluoreszierenden konfokalen Mikroskops auf und wählen Sie Live-Bildgebungsbedingungen in der zugehörigen Software aus. Um gute repräsentative Daten zu erhalten, wählen Sie die höchste Bildrate, stellen Sie den Verschluss auf Öffnen ein und wenden Sie ein Vier-mal-Vier-Binning in einem Zuschnitt des Erfassungsbereichs an, um die kürzesten Intervalle zwischen den Bildern während der Zeitrafferaufnahme zu erreichen.
Wenn die Schlagrate der Zellen niedrig ist, rufen Sie die Zellen durch elektrische Feldstimulation hervor und starten Sie die Zeitrafferaufnahme, wobei Sie darauf achten, dass das abgebildete Feld während der Bildgebung im Fokus bleibt. Speichern Sie am Ende des Imaging-Zeitraums die Zeitrafferbilder in einem entsprechenden Ordner. Um die Zeitrafferbilder zu analysieren, öffnen Sie eine Reihe von Zeitrafferbildern in ImageJ und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der Bilder an, bis das Sarkomermuster deutlich beobachtet werden kann.
Wählen Sie im Menü Weitere Extras die Option SarcOptiM aus, und drücken Sie die Umschalttaste P und die Ein-Mikrometer-Taste auf der Symbolleiste, um die Anweisungen zum Kalibrieren des Programms zu verwenden. Zeichnen Sie dann eine Linie über den Bereich des Sarkomers, der zur Messung der Sarkomer-Verkürzung verwendet werden soll, und klicken Sie auf Einzelzell-AVI, um die Sarkomer-Verkürzungsanalyse zu starten. Die Zeitraffer-Bildgebung von Sarkomer-markierten, gemusterten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen.
Um die Sarkomerdesorganisation zu überwinden, die typischerweise in gemusterten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozytenkulturen beobachtet wird, können spezifische PDMS-Stempel verwendet werden, um gemusterte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten in einem Streifenmuster zu kultivieren, das eine längliche Zellform und ein organisierteres Sarkomermuster im Vergleich zu Zellen fördert, die in einem Nicht-Musterbereich kultiviert wurden. Gemusterte Kulturen fördern auch eine bessere Zellkontraktion und bieten ein glattes Sarkomerlängenprofil im Vergleich zu nicht musterkulierten Zellen. AAV-transduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten exprimieren sarkomerische GFP-Signale entlang der gemusterten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten bereits drei Tage nach der Transduktion und können auch zur Messung von Sarkomerkontraktionsprofilen verwendet werden.
Darüber hinaus kann die Zugabe eines Blasticidin-resistenten Gens während der Transduktion auch verwendet werden, um die Selektion von gemusterten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten auf eine Reinheit von über 90% zu erleichtern Um eine einfachere und qualitativ hochwertigere Bildanalyse zu ermöglichen, ist es wichtig, einen Bereich mit Sarkomeren zu identifizieren, die sich linear bewegen, und Bilder mit der höchsten Bildrate zu erhalten. Mit dieser Methode können wir die Rolle der Reifung in Sarkomproteinen beurteilen, um Sarkomerdysfunktion in Laborkardiomyozyten zu untersuchen, die aus krankheitsspezifischen, patientenbezogenen iPS-Zellen gewonnen werden.
