Die Erforschung von Herzerkrankungen wird oft bei kleinen und Säugetieren wie Nagetieren durchgeführt. Die Physiologie des menschlichen Herzens unterscheidet sich jedoch deutlich von der des Nagetierherzens. Unser Protokoll verwendet Kardiomyozyten, die von menschlichen iPS-Zellen unterschieden werden, um ischämische Herzerkrankungen zu modellieren und die Schäden und funktionellen Beeinträchtigungen von imischen Kardiomyozyten zu quantifizieren.
Dieses Protokoll kann eine praktische Methode für personalisierte sdrug screening mit iPS-Zellen von einzelnen Patienten abgeleitet bieten, die angemessene Handhabung der iPS-Zellen, wie bei der Verwendung von frischem Medium, und das Mittel langsam und pünktlich zu wechseln ist entscheidend, um eine erfolgreiche Differenzierung in funktionelle Kardiomyozyten zu gewährleisten. Das Verfahren mit Yun Liu, Yin Liang und Mengxue Wang demonstriert Chen Wang, ein Doktorand aus einem Labor. Um die vom Menschen induzierte pluripotente Stammzelldifferenzierung in Herzzellen zu induzieren, beschichten Sie zunächst die Brunnen einer 96-Well-Kulturplatte mit 100 Mikrolitern von 1,675 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS.
Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, sehen Sie dreimal 10 bis die vierten Stammzellen in 200 Mikroliter IPS-Wartungsmedium mit 10 Mikromolaren Y27632 in jedem Brunnen ergänzt, und geben Sie die Platte an den Cell Culture Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach 24 Stunden die Supermittel durch 200 Mikroliter IPS-Wachstumsmedium pro Brunnen und geben Sie die Platte für weitere zwei bis drei Tage an den Cell Culture Inkubator zurück. Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen.
Ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter vorgewärmten Differenzierungsmedium A und geben Sie die Platte für weitere 48 Stunden an den Cell Culture Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation ersetzte langsam der Überstand in jedem Brunnen mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Differenzierungsmedium B und gab die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach zwei Tagen die Überwältstoffe durch 200 Mikroliter vorgewärmtes Kardiomyozyten-Pflegemedium pro Brunnen und bringen Sie die Platte für bis zu 30 Tage an den Cell Culture Inkubator zurück.
Um die Kontraktilität der Kardiomyozyten zu beurteilen, installieren Sie das Partikelbild-Velocimetrie-Bild-j-Plugin und verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop und das Gabelziel, um Videobilder der Zellen mit etwa 20 Bildern pro Sekunde für etwa 10 Sekunden aufzunehmen. Speichern Sie dann die Videodatei wie unsere API analysiert und erstellen Sie eine Ordnerstruktur wie angegeben. Um diskrete zweidimensionale Vektorfelder der Zellverschiebung zu analysieren, starten Sie VG und wählen Sie Plugins, Makros und bearbeiten, um Vektoranalysen zu öffnen.
ijm, dann klicken Sie auf Ausführen der Analyse wird automatisch durchgeführt. Für die ischämische Behandlung den Überstand in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter dmem ohne Glukose und Serum ersetzen, dann die Platte in eine Hypoxische Kammer geben und dann Stickstoffgas in die Kammer einfließen lassen, wobei die interne Sauerstoffkonzentration bei 2% und die Kohlendioxidkonzentration 24 Stunden lang bei 5% bleiben. Erfolgreich differenzierte Zellen, zeigt spontane Kontraktion, wie unter dem Mikroskop beobachtet mit 50% der Kulturbrunnen in der Regel zeigt spontane Kontraktion in weniger als 20 Tagen.
Herzmarker-Protein kann auch verwendet werden, um eine erfolgreiche Differenzierung zu bestätigen Zellen aus der ischämischen Gruppe zeigen in der Regel eine geringere Lebensfähigkeit in MTT-Assays, und eine geringere Kontraktilität als diejenigen aus der normoxischen Kontrollgruppe. Das Verhältnis der Propidiumjodid-positiven Zellen ist auch in der ischämischen Gruppe höher als in der Kontrollgruppe, was auf eine höhere Inzidenz von Zellschäden hindeutet. Es ist wichtig, dass Sie die Relevanten Bereiche in der Erfassungsplatte genau lokalisieren, um einen Vergleich der Kontraktilität der Kardiomyozyten zu ermöglichen.
Diese Technik kann für das Arzneimittelscreening verwendet werden, mit Patienten abgeleiteten iPS-Zellen. Es bietet auch eine einzigartige Plattform für die weitere Aufklärung der Mechanismen, die ischämischen Herzkrankheiten zugrunde liegen
