The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren wurden von der UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Kryokonservierung und Fixierung von embryonalen Maus-Herzen. 1.1) Snap-Gefrier embryonalen Herzen <ol><li> Füllen Sie ein 3,5 cm Petrischale und 7 mm cryomolds mit optimalen Schneidtemperatur (OAT) Medium (siehe Werkstoff-Tabelle). In einer chemischen Haube abkühlen 2-Methylbutan in flüssigem Stickstoff. </li><li> Verzichtet werden 30 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in 10 cm-Petrischalen mit 10 ml PBS in 3,5 cm-Petrischalen, und legen alle Petrischalen auf Eis. Bereiten Sie eine 10 cm-Schale und mehrere 3,5 cm-Schalen pro schwangere Maus. </li><li> Isolieren Embryonen wie zuvor beschrieben 15, die Durchführung der Präparation in eiskaltem PBS. </li><li> Kurz gesagt, einschläfern die schwangere Frau mit CO 2 Narkose und Genickbruch. <ol><li> Einen Einschnitt in den Bauch, sezieren die Gebärmutter, indem die Gefäße along der Innenwölbung der Gebärmutter, und übertragen Sie die Gebärmutter zu einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS. </li><li> Schneiden Sie die Gebärmutter zwischen jedem Embryo und den Transfer zu einem einzelnen 3,5 cm Petrischale mit eiskaltem PBS. Isolieren jedes Embryo wie beschrieben 15. </li><li> Öffnen Sie die Perikardhöhle mit feinen Pinzette, entfernen Sie das Herz von den Lungen und Blutgefäße, indem an der Aorta, untere Hohlvene und Lungenvenen und übertragen in die 3,5 cm Petrischale mit Oktober </li><li> Lassen Sie das Herz ins Gleichgewicht im Oktober für einige Sekunden, dann in den 7 mm Form, die OCT übertragen das Herz. Ausrichten der vorderen Wand des Herzens zu dem Boden der Form. </li></ol></li><li> Legen Sie vorsichtig die Form, in flüssigem Stickstoff gekühlten 2-Methyl. Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, 2-Methyl Flüssigkeit des OAT oder Herz berühren. Einfrieren, bis die Oktober stetig weiß, übertragen Sie dann die Form, um ein Eis Eimer mit Trockeneis. Fahren Sie mit dem nächsten Embryo. </li><li> Wrap cryomolds in Folie und bei -80 ° C, bis sie zur Kryoschneiden. </li></ol> 1.2) Alternative: Paraformaldehyd (PFA) Befestigungs, Gefrierschutz und Oktober Einbettung embryonalen Herzen <ol><li> Füllen Sie die Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturplatte mit 4% PFA in 1x PBS. </li><li> Präparieren Sie die embryonalen Herzen wie in 1.1.3 beschrieben. Legen Sie jedes Herz in einen Brunnen mit 4% PFA und fixieren bei 4 ° CO / N. </li><li> Kryoschutz: Verwendung eines Kunststoffüberführungspipetten Bewegen jedes Herz zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 1,5 ml 15% Saccharose in PBS und sanft zu rühren bei 4 ° C, bis das Herz sinkt auf den Boden des Röhrchens (mehrere Stunden bis zu O / N ). Übertragen jedes Herz in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 1,5 ml 30% Saccharose in PBS und sanft zu rühren bei 4 ° C wieder, bis das Herz sinkt auf den Boden des Röhrchens (mehrere Stunden bis zu O / N). </li><li> Mit einem Kunststofftransferpipette, legen Sie die kryogeschützt Herz in Oktober und lassen Sie es ins Gleichgewichtfür einige Minuten, um überschüssige Saccharose zu entfernen, dann übertragen Sie die Herzen in die 7 mm enthaltende Form Oktober Ausrichten der vorderen Wand des Herzens zu dem Boden der Form. </li><li> Frieren Sie das Herz im Oktober, indem die Form entweder in flüssigem Stickstoff gekühlten 2-Methyl oder Trockeneis. </li><li> Wickeln Sie cryomolds in Folie und bei -80 ° C, bis sie zur Kryoschneiden. </li></ol> 2. Kryoschneiden <ol><li> Eingestellt Kryostattemperatur bis -17 ° C. </li><li> Platz cryomolds in die Kryostatkammer und ins Gleichgewicht zu Temperatur für 15-20 min. </li><li> Kehren Sie die cryomold und verwenden sanften Druck auf das Herz-Block aus der Form zu vertreiben. Ausrichten der vorderen Wand des Herzens an die Spitze des geformten Gewebeblock. </li><li> Platzieren Sie einen großen Tropfen Oktober auf das Futter, und montieren Sie die AV-Block auf den Oktober Drop auf das Futter einfrieren. Halten der Ausrichtung, so dass die vordere Wand des Herzens ist die am weitesten von der Spannvorrichtung. </li><li> Laden Sie das Spannfutter und bestieg erKunst Block auf dem Kryostaten Objektträger. Einzustellen, so dass der Winkel der Klingen 3-5 ° relativ zu der Probe ist. </li><li> Sammeln Sie 10 um Schnitte auf Objektträger, die mit einer positiv geladenen Beschichtung vorbehandelt wurden (siehe Werkstoff-Tabelle). Lassen Sie vor der Lagerung bei -80 ° C vollständig trocknen. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz <ol><li> Für Snap-Gefrierschnitten und gezielt durchlässig Gewebe in Aceton für 10 min in einem Abzug bei RT. </li><li> Zur schockgefroren und PFA-fixierten Schnitten, Inkubation in PBS-0,1% Triton X-100 für 20 min OCT zu entfernen und PFA-fixierten Schnitten permeabilisieren. </li><li> Block für 45 min in 1 × Blockierungspuffer in PBS verdünnt. </li><li> Bei Verwendung eines primären Antikörpers in der Maus erzeugt, Inkubation in Esel oder Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) einwertige Fab-Fragment 1: 100 verdünnt in PBS-0,1% Tween 20 für 45 min bei RT (siehe Diskussion). </li><li> Inkubieren in primären Antikörper oder Antikörper in 1x Blockierungspuffer für 2 h bei RT oder verdünntO / N bei 4 ° C (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für bestimmte Verdünnungen). </li><li> Auswaschbereiche in 1x PBS dreimal für 10 min bei RT. </li><li> Inkubiere in Alexa Fluor-konjugierten sekundären Antikörper, verdünnt 1: 500 in Blockierungspuffer für 2 h bei RT, vor Licht geschützt. </li><li> Auswaschbereiche in 1x PBS dreimal für 10 min bei RT, vor Licht geschützt. </li><li> Optional: Inkubieren in Hoechst-Farbstoff verdünnt 1: 2000 in PBS bei Raumtemperatur (lichtgeschützt) an Kernen beschriften, dann mit PBS spülen. </li><li> Post-Lösung für 1 min bei RT markierte Abschnitte in 1% PFA. </li><li> Halterung gleitet in anti-fade Medium, indem zwei Tropfen des Mediums an jedem Ende des Schiebers und Abdecken mit einem Deckglas (mit DAPI wenn Kerne nicht bereits beschriftet). Seal Deckgläser mit Nagellack. Shop von Licht bei 4 ° C bis zu seiner Bild geschützt. </li></ol> 4. Die konfokale Bildgebung und Bildanalyse <ol><li> Schalten Sie den entsprechenden Laserwellenlängen, die Kamera und Konfokalmikroskop incLuding Bühnenmaschine und z-Motor. Starten Sie die Imaging-Software-Programm. Verwenden Sie die 405, 488 und 561 Laserwellenlängen zur Abbildung Hoechst-, Alexa 488- und Alexa 568-gefärbten Schnitten auf. HINWEIS: Siehe Werkstofftabelle für unsere Hard- und Software-Spezifikationen. </li><li> Montieren Sie den Steuerschieber (Deckglas nach unten für ein inverses Mikroskop) auf der Folie der Bühne. </li><li> Mit dem Ziel, 4X (siehe Werkstoff-Tabelle), finden die Probe und Bereich von Interesse. Nehmen Sie das Bild als eine Karte zu verwenden, wenn die Abbildung bei hoher Vergrößerung. </li><li> Entfernen Sie die Folie, so dass minimale Anpassungen an der Rutsche Bühne. Wechseln Sie in das 60x Ölimmersionsobjektiv (siehe Werkstoff-Tabelle), legen Sie einen kleinen Tropfen Öl auf das Ziel, und ersetzen Sie den Schieber (Deckglas nach unten) auf den Objektträger Bühne. </li><li> Finden Probe wieder. Stellen Sie die Laserleistung, Belichtungszeit und Binning auf die gewünschten Werte für jeden Kanal. HINWEIS: Wir verwenden im Allgemeinen Laserleistung von 0,8, Kamera Belichtungszeit von 100 ms und Binning von 2 (seE-Werkstoff-Tabelle für die Hardware- und Software-Spezifikationen); optimalen Einstellungen müssen empirisch für jedes Experiment ermittelt werden. <ol><li> Sobald die optimalen Einstellungen festgelegt sind, die gleichen Einstellungen für alle Gewebeschnitte innerhalb des Experiments. Verwenden Sie das Intensitätshistogramm, um die optimale Intensitätsbereich für jeden Kanal beachten (diese Informationen werden für die Analyse verwendet werden). </li></ol></li><li> Gene az Stapel der Erwerbsfunktion: Wählen Sie die entsprechenden Laserkanäle, wählen Sie die obere und untere Grenze des Z-Stack. Wählen az Stapelschrittweite, die der Hälfte des Wertes der optischen Schichtdicke durch die Software bereitgestellt wird. Klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;, um die Bilder zu sammeln. </li><li> Verwenden Fiji 16 oder ein vergleichbares Programm für die Bildanalyse. Innerhalb Fiji, öffnen Sie die Stapeldatei z mit benutzerdefinierten Farbmodus und den Kanälen in separate Fenster unterteilt. Öffnen Sie das &quot;Anpassen von Helligkeit / Kontrast&quot; Werkzeug aus dem Bild Pulldown-Menü; innerhalb jedes Kanals, set in 4.5.1 die optimale Histogramm Intensitätsbereich bestimmt. Übernehmen Sie diese Kanalbereiche für alle z Stapel analysiert. </li><li> Zusammenführen der einzelnen Kanäle zu einem einzigen zusammengesetzten Bild mit Bild-&gt; Farbe Pulldown-Menü. </li><li> Erstellen Sie eine abgeflachte z Stapel aus dem zusammengesetzten Bild mit dem Image-&gt; Stacks-&gt; z Projektmenü. Dieses Bild deutlich heller als das 3D-Bild ist; stellen Sie die Histogramm-Intensitätsbereich für die Kontrollprobe eine Übersättigung zu vermeiden, und die gleichen Einstellungen auf die experimentelle abgeflacht z-Stack. </li><li> Um ein 3D-Bild zu erzeugen, verwenden Sie zuerst die Image-&gt; Stacks-&gt; 3D-Projekt-Menü 17. Wählen entweder der x-Achse oder y-Drehachse. Stellen Sie die Schnittabstand als die gleiche Anzahl von Mikrometern, wie z Stapelschrittweite. Wählen Sie die gewünschte Gesamtdrehung und stellen Sie den Drehwinkel-Schritten, um 1. Öffnen Sie dann das Bild J 3D Viewer von den Plugins Pulldown-Menü. Wählen Sie die in 4.8 erzeugt zusammengesetzte Bild, Display Lautstärke, und stellen Sie die ReSampling-Faktor 1 oder 2. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die optimale Gewebefixierung Technik und Verdünnung müssen empirisch für jeden Antikörper bestimmt werden. In unseren Händen, Schnapp Einfrieren überlegen ist PFA Fixierung für mehrere Herzmuskelantigene, einschließlich e-α-Actinin, β-Catenin, β1-Integrin, Tropomyosin, Talin (nicht dargestellt) und N-Cadherin; Dagegen ergibt PFA Fixation legene Ergebnisse für focal adhesion kinase (nicht gezeigt). Die Protein-Quervernetzungen von PFA gebildete Epitope und Grenze Antikörperbindung zu maskieren; Antigen-Retrieval kann in solchen Fällen erforderlich sein, und Methoden für die Antigen-Retrieval an anderer Stelle 20 zu finden. PFA-Konzentration oder die Länge der Fixierung kann verringert werden, um Epitop Maskierung zu reduzieren, mit optimalen Bedingungen empirisch für jeden Antikörper und an jedem Entwicklungsstadium bestimmt. Entsprechenden Negativkontrollen bei der Charakterisierung eines neuen Antikörper oder Herz Mutante einschließlich Präimmunserum als primäre Antikörperkontrolle und ein &quot;kein primärer Antikörper&quot; gemeinsam genutzt werdenntrol. Die Verwendung von Knockout-Mäusen ist ein idealer Negativkontrolle aber frühe Letalität verhindert ihre Verwendung für viele der Genprodukte hier untersucht. Verwendung ausreichender Mengen ein komplettes Abtauchen experimentellen und Kontrollobjektträger in der gleichen Immunfluoreszenz-Blockierung, Antikörper und Waschlösungen war wichtig, da war sanfte Schaukeln der Folien während der Inkubation, um eine gleichmäßige Belichtung der Abschnitte zu den Lösungen zu gewährleisten. Dieser Ansatz minimiert technische Variabilität in der Färbung zwischen den Abschnitten und gleitet in einem Experiment. Wenn Kosten begrenzt die Antikörperlösung Volumen, mit einem Pap-Stift, um den Fluss von Lösungen über die Gewebeabschnitte zu begrenzen und zu halten Objektträger in einer feuchten Kammer bei längeren Inkubationszeiten. Wenn ein monoklonaler Maus Primärantikörper - und damit eine anti-Maus-Sekundärantikörper - eingesetzt wird, wird eine zweite Sperrstufe auf endogene Maus-Immunglobuline Bedeckung notwendig (Schritt 3,4) zu sein, um die unspezifische Hintergrundsignal zu verringern. Geeignete Mikroskopie und Bildverarbeitungstechniken sind kritisch, um biologisch genaue Informationen 21. Die Intensität Histogramm zeigt die Verteilung der Pixel für jede Intensitätsstufe (0 - 65535 Pegel für eine 16-Bit-Bild) für jede Farbe. Hintergrund, können Helligkeit und Kontrast, indem Sie eine Intensität Anzeigebereich, die das Histogramm Spitzenflanken eingestellt werden; aussagekräftige Vergleiche zwischen den Bedingungen zu machen, müssen die gleichen Einstellungen zwischen Steuerung und experimentellen Bedingungen verwendet werden. Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige Methode, um Kardiomyozyten Reifung und Entwicklung in der nativen embryonalen Mäuseherz analysieren. Während Immunfluoreszenz von Kardiomyozyten-spezifische Proteine ​​wird häufig verwendet, um Herzmuskelzellen während der Entwicklung zu markieren, nur wenige Studien verwenden Techniken, die hochauflösende Analyse der Myofibrillen Struktur und die Entstehung von Glanzstreifen und Costameren 12-14,22,23 ermöglichen. Diese Technik kann in v verwendet werdenivo Beurteilung von Mutationen, die Entwicklungsherzfehler verursachen, als ein Mittel zur Ermittlung von Veränderungen in Kardiomyozyten Reifung, die Aufschluss über Mechanismen der strukturelle Anomalien zu vergießen kann.

Bei der Entwicklung beginnen Herzkontraktionen bald nach Kardiomyozyten wandern zur Mittellinie und bilden die lineare Herz Rohr 1,2. Die sarcomere ist die Grundeinheit in der kontraktilen Kardiomyozyten; Diese hochorganisierten Zytoskelettstruktur enthält Aktinfilamente zu der Z-Scheibe durch sarcomeric α-Actinin (n-α-Actinin) und Myosin Fasern zum M Leitung verankert (Figur 1) verankert ist. Wie der Kardiomyozyten reift, montieren Sarkomere in Reihe Myofibrillen, die über die Zelle zu verlängern bilden. Myofibrillen sind an den Enden der Kardiomyozyten durch interkalierten Scheibe verankert ist, die Zell-Zell-Junction-Struktur, die ein Übergangsverbindungsstelle mit einer Untergruppe von Z-Scheibenelemente wie S-α-Actinin 3, adherens enthält junction-Proteine, wie N-Cadherin und β-Catenin, Gap Junction-Proteine ​​und Desmosomen (Abbildung 1) 4. Entlang der Längs Membran, der Z-Scheiben peripherer Myofibrillen auchheften sich an die Zellmembran über Costameren; diese spezialisierten fokalen Adhäsionen stellen ein Anker zwischen der Myofibrillen, Plasmamembran und die extrazelluläre Matrix, um eine zusätzliche strukturelle Unterstützung für die Herzmuskelzelle bereitzustellen (Figur 1) 4. Am frühen Herzentwicklung sind Kardiomyozyten in fingerartigen Projektionen Knochenbälkchen bekannt, die in den Raum ragen ventrikuläre und enthalten relativ ausgereift Myofibrillen 5 angeordnet. Da die Entwicklung des Herzens verläuft, die Kardiomyozyten in dem Teilbereich epikardialen proliferieren, um die kompakte Myokards, die die Herzkammerwände umfasst, aber sarcomere und Myofibrillen Anordnung verglichen mit trabekulären Myokard 5,6 verzögerten bilden. Modelle von Sarkomer und Myofibrille Montage weitgehend stammen aus Immunfluoreszenzstudien an kultivierten Kardiomyozyten 7-10, die einfach sind, aber nicht über eine dreidimensionale Umwelt, Durchblutung, und Kontakte mit anderen kardialen Zells in vivo vorhanden. Hochauflösende Strukturuntersuchungen mittels Immunfluoreszenz in der Maus embryonalen Herzen sind technisch anspruchsvoll, und nur wenige Studien haben die Entstehung von Glanzstreifen und Costameren während Maus Herzentwicklung erforscht. Die adherens junction Protein β-Catenin scheint mit Glanzstreifen von embryonalen Tag (E) 17.5 11, lokalisiert N-Cadherin, lineare Strukturen, die Glanzstreifen von E18.5 12 im Vergleich zu postnatalen Tag 0 13 darstellen können, und Costameren haben bei erkannt lokalisieren E18.5 14, aber diese Proteine ​​zeigen diffuse und kontinuierliche Membranverteilung bei früheren Entwicklungszeitpunkten 11-13. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode zur Immunfärbung und Fluoreszenz-Mikroskopie von geschnittenen embryonalen Maus-Herzen, die für eine detaillierte Analyse von Myofibrillen und Kardiomyozyten Entwicklung, einschließlich der Entstehung intercala erlaubtted Discs bereits E12.5 und im Entstehen begriffenen Costameren bei E16.5. Dieses Protokoll kann nützlich für die Erforschung der Auswirkungen der Mutationen auf sarcomere Bildung sowie Myofibrillen und Kardiomyozyten Reifung sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:335px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 7x7 mm</td>
			<td style="width:167px;">Richard-Allen Scientific</td>
			<td style="width:160px;">58949</td>
			<td style="width:335px;">This size not available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 15x15 mm</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">22-050-159</td>
			<td style="width:335px;">Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td style="width:160px;">25608-930</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">2-methyl butane</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">M32631</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">T353-500</td>
			<td style="width:335px;">Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Sucrose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">S0389</td>
			<td style="width:335px;">Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">S30467-1</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-550-15</td>
			<td style="width:335px;">&#34;Plus&#34; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">179124</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Western Blocking Agent</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">11921673001</td>
			<td style="width:335px;">Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tween 20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">P9416</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td>
			<td style="width:167px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:160px;">715-007-003</td>
			<td style="width:335px;">Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:285px;">Anti-s-a-actinin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A7811</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-bcatenin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:160px;">9587s</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-b1 integrin antibody</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:160px;">AF2405</td>
			<td style="width:335px;">Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-tropomyosin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td style="width:160px;">CH1</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:160px;">sc-7939</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-talin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">T3287</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:160px;">700255</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-21202</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A10042</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11001</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11011</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Hoechst 33342 dye</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">H3570</td>
			<td style="width:335px;">Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vectashield</td>
			<td style="width:167px;">Vector labs</td>
			<td style="width:160px;">H-1000</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-548-5M</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td>
			<td style="width:167px;">Keysight (formerly Agilent)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Clara Interline CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">CFI Plan Apochromat 4X air objective</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NA 1.4, WD 0.13 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">NIS Elements Imaging Software</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;">http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:167px;">Fiji</td>
			<td style="width:160px;">http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

Während die Entwicklung des Herzens, die Erzeugung von Myokard-spezifischen strukturellen und funktionalen Einheiten einschließlich Sarkomeren, kontraktile Myofibrillen Glanzstreifen und Costameren erfordert die koordinierte Anordnung mehrerer Bauteile in Zeit und Raum. Störungen in der Montage dieser Komponenten führt zu Entwicklungsherzfehlern. Immunofluoreszenzfärbung Techniken werden allgemein in kultivierten Kardiomyozyten zur Myofibrille Reifung zu untersuchen, aber dieser ex vivo-Ansatz wird durch das Ausmaß beschränkt, auf die Myozyten vollständig differen in Kultur, Fehlen der normalen in vivo mechanische Eingaben, und in Abwesenheit von endokardialen Cues. Anwendung von Immunfluoreszenztechniken zur Untersuchung der Entwicklung der Maus Herz ist wünschenswert, aber technisch schwierigen und Verfahren mangelt es oft an ausreichender Empfindlichkeit und Auflösung zu Sarkomeren in den frühen Stadien der Entwicklung des Herzens zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein robustes und reproduzierbares Verfahren zur Zusammenarbeit immunostain multiple Proteinen oder zur Zusammenarbeit zu visualisieren ein fluoreszierendes Protein mit Immunfluoreszenzfärbung in der embryonalen Maus Herz und diese Methode verwenden, um der Entwicklung Myofibrillen, Glanzstreifen und Costameren analysieren. Das Verfahren kann weiterhin verwendet werden, um Kardiomyozyten strukturellen Veränderungen durch Mutationen, die zu Entwicklungsherzfehlern führen verursacht zu bewerten.

Die Figuren 2 bis 6 zeigen typische Ergebnisse für die Co-Färbung von verschiedenen Proteinen in einem schockgefroren und Aceton-fixierte Herz. Der Antikörper gegen S-α-Actinin reproduzierbar markierten Z-Scheiben und Glanzstreifen mit hoher Spezifität und minimaler Hintergrund (2A, 3A, 4A, 5A, 6A und 6C), Figur 6 zeigt, daß die Anti-Maus-IgG (H + L) monovalenten Fab-Fragment blockiert effektiv endogenen Maus-IgG-Bindung von Anti-Maus Sekundärantikörper. Der Antikörper gegen adherens Junction Protein β-Catenin gebunden Membran beider Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten-Zellen, und die Co-Lokalisierung mit S-α-Actinin trat bei vermuteten Glanzstreifen an E16.5 (2C und D), wie aus der erwartete β-Catenin-Färbungsmuster im erwachsenen Herzen 18. β1 Integrin Immunfluoreszenz in der embryonalen Herz ist besonders anspruchsvoll und oft nicht fokalen Adhäsionen 14 zu identifizieren, aber β1-Integrin-Färbung in diesen Studien zeigten Signal mit der gleichen Periodizität wie n-α-Actinin-markierten Z-Scheiben, was möglicherweise entstehenden Costameren Bilden E16.5 (Figur 3D). Bei E12.5, S-α-Actinin und Tropomyosin (Sarkomer dünnen Faden Protein) Immunfluoreszenz ergab eine Färbungsmuster mit regelmäßigen Periodizität in trabekulären Kardiomyozyten, die mit reifen Myofibrillen in diesen Zellen (4A und 5A für s-α-Actinin; 4B für Tropomyosin). N-Cadherin-Färbung in trabekulären Kardiomyozyten bei E12.5 Herzen neigten, mit Gebieten mit hohen S-α-Actinin-Färbung (5B - D und 6A - C) kolokalisiert möglicherweise, Glanzstreifen. InIm Gegensatz zum trabekulären Myozyten, S-α-Actinin im kompakten Zone war punctata als linear, und Tropomyosin Färbung war diffus und nicht linearen (4A und 4B). So kann Sarkomer Montage später in kompakter auftreten, verglichen mit trabekulären Myokard. Weiterhin Differenzmustern von S-α-Actinin und Tropomyosin in der kompakten Zone zeigen, dass S-α-Actinin organisiert in puncta und unreife Z-Scheiben früh, während Tropomyosin Einbau in den dünnen Faden kann ein späteres Ereignis in Myofibrillen Anordnung sein. 7, Film 1 und Video 2 zeigen typische Ergebnisse aus einer PFA-Fest E12.5 embryonalen Herzen. In diesen Beispielen wurde ein LifeAct-RFPruby transgenen Embryo zur Bildgebung verwendet wird; die LifeAct-RFPruby Transgen 19 Etiketten filamentösen Aktin erfordert aber PFA Fixierung. Z-Discs mit s-α-Actinin-markiert waren leicht in den meisten Bereichen sichtbar, aber das Signal-Rausch-Verhältnis betrug Decre<html> ASED gegenüber schockgefroren Herzabschnitte (7A); dieses Signal typisch für s-α-Actinin Immunofluoreszenz in PFA-fixiertem Gewebe, in denen Epitope können durch Proteinquervernetzungen maskiert war. 7B zeigt Co-Visualisierung von polymerem Aktin und immun s-α-Actinin innerhalb Myofibrillen (Pfeilspitzen) und polymerem Aktin in endokardialen Zellen benachbart trabekulären Myozyten (Pfeile). Dreidimensionales Bildrekonstruktions ergab zusätzliche Details: einzelne Kardiomyozyten leichter erkennbar, Myofibrillen innerhalb eines Kardiomyozyten wurden in etwa parallel zueinander, aber einzelne Kardiomyozyten wurden in unterschiedlichen Winkeln zueinander (7C und D, Video 1 und Video 2 orientierten ). Die Annäherung zwischen endokardiale Zellen und Kardiomyozyten wurde besser in die dreidimensionale Ansichten schätzen auch. <html> &quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> Abbildung 1. Cardiomyocyte Sarkomere, Glanzstreifen und Costameren. Die Z-Scheibe verankert Aktinfilamente, während die M-Linie verankert Myosin-Fasern, die die Aktin-Filamente überlappen. Das Sarkomer besteht aus einer Z-Scheibe - M Linie - Z-Platteneinheit. Mehrere Sarkomere in Serie schaffen eine Myofibrille. Das Seitenende des Myofibrille fügt in den Querrand des Kardiomyozyten zu einem spezialisierten Zell-Zell-Junction-Struktur, die als das interkalierte Scheibe. Periphere Myofibrillen eine Verbindung mit dem Längs Kardiomyozyten Plasmamembran über Costameren, der fokalen Adhäsionen mit der extrazellulären Matrix zwischen Herzmuskelzellen zu bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> pload / 52.644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. s- α und β-Catenin -actinin Immunfluoreszenz an embryonalen Tag 16,5. Das Herz wurde herausgeschnitten, Schnappeingefroren, gefriergeschnitten, mit Aceton fixiert und immunhistochemisch mit (A) monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen Klon EA53 s-α-Actinin, die beschriftet Kardiomyozyten Z-Scheibe und Glanzstreifen, und (B) Kaninchen polycloncal Antikörper gegen das adherens junction Protein β-Catenin. (C) zusammengeführt Bilder zeigen n-α-Actinin und β-Catenin-Färbung. (D) des vergrößerten Bereichs von Interesse von Feld C ; Sternchen markieren vermutet Glanzstreifen mit Co-Lokalisierung von e-α-Actinin und β-Catenin. Bilder wurden aus dem peripheren linksventrikuläre Wand oder kompakten Myokard erhalten, mit der epikardialen Schicht an der oberen linken Ecke des Panels AC. Intensity Histogrammanzeige Bereich 460-1600 (aus of möglich 0-65535) für sowohl die n-α-Actinin / 488 nm und β-Catenin / 561 nm Laserkanäle. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> Abbildung 3. s- α -actinin und β 1 -Integrin Immunofluoreszenz bei Embryonaltag 16,5. Das Herz wurde herausgeschnitten, schockgefroren, gefriergeschnitten, Aceton-fixiert und immunhistochemisch unter Verwendung von (A) monoklonalen Maus-Klon EA53 Antikörper gegen S-α-Actinin (B) Ziegen polyklonalen Antikörpers gegen die Brenn Adhäsionsprotein β1 Integrin. (C) zusammengeführt Bilder zeigen β1 Integrin in Kardiomyozyten als auch nicht-Kardiomyozyten Zellen. Beachten Sie, sowohl diffus undpunctata β1-Integrin-Signal in Kardiomyozyten (D) des vergrößerten Bereichs von Interesse von Feld C Hinweis punktförmige, periodische β1-Integrin-Färbung (Pfeile) mit ähnlichen Periodizität wie in der Nähe S-α-Actinin-Färbung in Z-Scheiben. diese Strukturen Costameren darstellen. Bilder wurden aus dem linksventrikulären kompakte Myokard erhalten. Intensity Histogrammanzeige Bereich 460-1200 (außerhalb der möglichen 0-65535) des n-α-Actinin / 488 nm Laser-Kanal und 460 bis 600 für die β1 Integrin / 561-nm-Laserkanal. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> Abbildung 4. s- α -actinin und Tropomyosin Immunfluoreszenz an embryonalen Tag 12,5: Myofibrille Organisation<html> trabekulären und kompakt Myokard. Herzen von littermate Embryonen wurden herausgeschnitten, schockgefroren, gefriergeschnitten, Aceton-fixiert und immunhistochemisch unter Verwendung von (A) monoklonaler Maus-Klon EA53 Antikörper gegen S-α-Actinin (B) monoklonaler Antikörper der Maus gegen den Myofibrillen dünnes Filament Protein Tropomyosin (Developmental Studies Hybridoma Banküber CH1). Trabecular (Pfeile) und kompakte Myokard (Pfeilspitzen) werden angezeigt. Anmerkung lineare S-α-Actinin-Färbung mit regelmäßiger Periodizität in der trabekulären Myokard im Vergleich zu einem Bereich von Färbungsmustern einschließlich puncta sowie lineare Färbung in der Kompaktschicht (A). Beachten Sie auch, lineare Tropomyosin Färbung mit regelmäßigen Periodizität in der trabekulären Myokard aber diffuse Färbung in kompakter Myokard. Intensity Histogrammanzeige Bereich 460-1,400 (von möglichen 0-65535) des n-α-Actinin-Kanal und 460-1,000 für die Tropomyosin Kanal. Maßstabsbalken 10 um.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> Abbildung 5. s- α -actinin und N-Cadherin-Immunfluoreszenz an embryonalen Tag 12,5:. Myofibrillen und Glanzstreifen in trabekulären Kardiomyozyten Das Herz wurde herausgeschnitten, Schnappeingefroren, gefriergeschnitten, Aceton-fixierten und immun mit (A) monoklonalen Maus-Klon EA53 Antikörper gegen das S-α-Actinin (B) Kaninchen-polyklonalen Antikörpers gegen den Brenn Adhäsionsprotein N-Cadherin. 0,2 um optische Scheiben wurden als az Stapel gesammelt und z Stapel wurden abgeflacht, um die Bilder zu erzeugen. (C) verschmolzen abgeflacht Stapeln sowohl N-Cadherin und S-α-Actinin-Färbung im trabekulären Kardiomyozyten als well als Kerne mit Hoechst-Farbstoff markiert (D) des vergrößerten Bereichs von Interesse von Feld C. Sternchen kennGlanzStreifen mit Colokalisierung s-α-Actinin und N-Cadherin. Intensity Histogrammanzeige Bereich 470-1,200 (von möglichen 0-65535) des Hoechst / 405 nm Laser-Kanal und 470-2,000 sowohl für den S-α-Actinin / 488 nm und N-Cadherin / 561 nm Laser-Kanälen. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> Abbildung 6. Anti-Maus-IgG (H + L) einwertige Fab-Fragment wirksam blockiert endogenen Maus-IgG-Bindung durch anti-Maus-Sekundärantikörper. Die E12.5 embryonalen Herzens wurde ausgeschnitten, schockgefroren, gefriergeschnitten, Aceton-fixiert und immunhistochemisch. <strong&gt; (AC) Schnitte wurden mit 1x Blockierungspuffer, gefolgt von Anti-Maus-IgG einwertige Fab-Fragment blockiert, um monoklonale Maus-Klon ausgesetzt EA53 primären Antikörper gegen S-α-Actinin und Kaninchen polyklonalen primären Antikörper gegen N-Cadherin, gewaschen und exponierten Alexa Fluor 488-anti-Maus und Alexa Fluor 586 Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper. (A) verschmolzen Bild mit Intensitätshistogramm Anzeigebereich von 480 bis 2500 (von möglichen 0-65535). Sternchen note Regionen, in denen N-Cadherin-Signal wird dem Querende des trabekulären Kardiomyozyten, die wahrscheinlich darstellt naszierenden Glanzstreifen (C) S-α beschränkt. (B) N-Cadherin-Kanal nur mit Intensitätshistogramm Anzeigebereich 480-2,500. -actinin geschützten Kanal mit Intensitätshistogrammanzeige Bereich 480-2,500. (DG) Die Schnitte wurden mit 1x Blockierungspuffer (keine anti-Maus IgG monovalenten Fab-Fragment Blockierungsschritt) blockiert, um polyklonalen Kaninchen ausgesetztBild primären Antikörper gegen N-Cadherin (keine Maus monoklonaler primärer Antikörper), gewaschen, und Alexa Fluor 488-Anti-Maus und Alexa Fluor 586-anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper ausgesetzt wird. (D) verschmolzen mit Intensitätshistogramm Anzeigebereich von 480 bis 2500. (E) N-Cadherin-Kanal nur mit Intensitätshistogramm Anzeigebereich von 480 bis 2500. (F) S-α-Actinin-Kanal nur mit Intensitätshistogrammanzeige Bereich 480-2,500. (G) S-α-Actinin-Kanal nur mit Hochempfindlichkeit Intensitätshistogramm Anzeigebereich 480 bis 530, die Hintergrunderkennung von endogenem Maus-IgG in Abwesenheit des Anti-Maus-IgG-Fab-Fragments einwertigen Blockierungsschritt offenbart. (HK) Schnitte wurden mit 1x Blockierungspuffer, gefolgt von Anti-Maus-IgG blockiert einwertige Fab-Fragment von Kaninchen polyklonalen primären Antikörper gegen N-Cadherin (keine Maus monoklonaler primärer Antikörper), gewaschen ausgesetzt und Alexa Fluor 488-Anti-Maus und eine freiliegendeLexa Fluor 586 Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper. (H) Bild verschmolzen mit Intensitätshistogrammanzeige Bereich 480-2,500. (I) N-Cadherin-Kanal nur mit Intensitätshistogrammanzeige Bereich 480-2,500. (J) S-α-actinin- einzige Kanal mit Intensität Histogrammanzeige Bereich 480-2,500. (K) n-α-Actinin-Kanal nur mit hochempfindlichen Intensitätshistogramm Anzeigebereich von 480 bis 530, die das Fehlen von Hintergrund endogenen Maus-IgG-Nachweis zeigt, wenn die anti-Maus IgG monovalenten Fab-Fragment Blockierungsschritt verwendet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> Abbildung 7. s- α -actinin und Aktin-Organisation in trabekulären cardiomyocytes am Embryonaltag 12,5. Die LifeAct-RFPruby transgene Mauslinie wurde verwendet, um polymerem Aktin 19 sichtbar zu machen, während die monoklonalen Maus-Klon EA53 Antikörper gegen S-α-Actinin wurde verwendet, um Z-Scheiben und Glanzstreifen zu beschriften. Die Embryonen wurden PFA-fixiert. 0,2 um optische Scheiben wurden als az Stapel gesammelt (A) abgeflacht z Stapel zeigt, daß S-α-Actinin-Färbung war in PFA-fixiertem Gewebe diffuser als in schockgefroren und Aceton fixiert Abschnitte (Figuren 2-5).. (B ) Abgeflachte z Stapel zeigt sowohl filamentösen Aktin und S-α-Actinin. Filamentösen Aktin Fluoreszenz zwischen Z-Scheiben in Myofibrillen (Pfeilspitzen) lokalisiert. Polymerem Aktin Fluoreszenz wurde auch in Zellen, die die endokardiale trabekulären Myozyten (Pfeile) Linie gesehen. (C), dreidimensionale Darstellung des trabekulären Kardiomyozyten, wie von der Spitze des Stapels betrachtet. (D) Dreidimensionale AnsichtDas trabekuläre Kardiomyozyten, wie aus dem unteren Ende des Stapels betrachtet. Intensitätshistogramm Anzeigebereich 470 bis 900 (von möglichen 0-65535) sowohl für den 488-nm-Laserkanal und für den 561-nm-Laserkanal in A und B; Anzeigebereich 460-800 für beide Kanäle in C und D Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">Film</a> 1. 360 ° Dreh 3D-Ansicht der s- α -actinin und Aktin-Organisation in trabekulären Kardiomyozyten an embryonalen Tag 12,5. Der Bildstapel von 6 wurde in drei Dimensionen mit dem Bild J 3D Viewer Plugin im Fiji Bildanalyseprogramm gemacht. Intensitätshistogramm Anzeigebereich von 470 bis 800 (von 0 bis 65.535 möglich) sowohl für die 488 nm und 561 nm Laserkanäle. &lt;/ P&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">Film</a> 2. Ausgewählte 3D-Ansichten von s- α -actinin und Aktin-Organisation in trabekulären Kardiomyozyten an embryonalen Tag 12,5. Der Bildstapel von 6 wurde in drei Dimensionen mit dem Bild J 3D Viewer Plugin im Fiji Bildanalyseprogramm gemacht. Kleine Drehungen um die x, y und z-Achse ausgerichtet ist, zeigten relativ Myofibrillen innerhalb Kardiomyozyten aber schlechte Ausrichtung zwischen den meisten Kardiomyocyten. Kleine Drehungen demonstriert auch die Annäherung der endokardialen Zellen ohne s-α-Actinin Umgebung Kardiomyozyten. Intensitätshistogramm Anzeigebereich von 470 bis 800 (von 0 bis 65.535 möglich) sowohl für die 488 nm und 561 nm Laserkanäle.

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Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.0K Aufrufe.  Northwestern University. Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Serie: Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...