BS wurde von der Universität Mailand-Bicocca Summer Student Research Training Programm unterstützt, die Forschung wurde aus Mitteln des italienischen Gesundheitsministeriums und der italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung und Fondazione Humanitas GC unterstützt; wir dank Michael VG Latronico für die kritische Durchsicht der Manuskript.

1. Feeder-freie Wartung und Passagieren der menschlichen iPS-Zelllinien <ol><li> Bereiten Sie die Matrigel-beschichteten Schalen. Tauwetter ein Fläschchen des menschlichen ESC qualifizierte Matrix auf Eis für eine Stunde und verdünnen Sie es in 25 ml DMEM-F12 Medium. 1 ml bis 35 mm je Platte (oder äquivalente Mengen pro Fläche, wenn andere Gerichte verwendet werden), halten alles auf Eis und sicherzustellen, dass alle Platten und Rohre vorgekühlt sind. Die Platten mit Aluminiumfolie. </li></ol> Hinweis: Matrigel stock Konzentrationen je nach der Partie. Dilution Anweisungen auf dem Datenblatt angegeben. <ol start="2"><li> Halten Platten auf Eis über Nacht und entfernen von Eis am nächsten Tag. Die Platten können im Kühlschrank aufbewahrt werden, bis zu einer Woche vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die mTESR1 Vollmedium (oder auftauen ein Fläschchen Nutristem mittel) und die H-ESM (human ESC mittel) gemäß der folgenden Tabelle. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> Endkonz. </td><td> Für 500 ml </td></tr><tr><td> Knockout Serum Replacement (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> MEM nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 100 U / ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> B27 Supplement - ohne VitaminA </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> N2 Supplement </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Auf Medium kann bei 4 ° C für nicht mehr als 2 Wochen gelagert werden. Um eine vollständige Nährmedium herzustellen, wird nur vor dem basischen FGF hinzugefügte Fütterung in einer Endkonzentration von 20 ng / ml. </li></ol> Hinweis: Komplette H-ESM auf embryonale Maus-Fibroblasten bedingt kann anstelle mTESR1 oder Nutristem für iPS-Zellen verwendet werden. <ol start="4"><li> Platzieren beschichteten Platten im Brutschrank bei 37 ° C für 30 min bis 2 h vor Passage. </li><li> Die Zellen sollten passagiert etwa alle 5 Tage, auch wenn sie nicht Zusammenfluss erreicht. Kolonien sollten sich nicht berühren. </li><li> Ersetzen Nährmedium mit 1 ml Dispase (1 mg / ml, gelöst von einer 10 mg / ml Brühe in PBS). </li><li> Entfernen differenzierenden Bereiche mit gezogenem Glas Pasteur Pipetten. Bereiche, die entfernt werden sollten kraterförmige oder zystische Strukturen in der Mitte der Kolonien, und alle Bereiche, in denen Zellen werden aus Kolonien getrennt und abgeflacht zu sein scheinen Migration nach außen. </li><li> Bei 37 ° C unter einer Kultur Haube bis Kolonie Grenzen heller geworden und beginnen zu lösen (in der Regel ca. 5-7 min). Discard Dispase. Waschen mit 1 ml H-ESM und zu verwerfen. </li><li> In 1 ml H-ESM, verwenden Sie eine Zelle Heber (Spachtel-wie Schaber) zur Ernte Kolonien und sammeln sich in einem 15 ml Eppendorf-Röhrchen. Spülen mit 1 ml H-ESM und zu dem Rohr. Spin bei 1.000 rcf für 4 min und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Pellet in 1 ml vorgewärmten Wachstumsmedium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Vermeiden Aufbrechen Klumpen zu viel - und Abpipettieren weniger als 6-8x. Ermitteln Sie, wie viele Zellen sollten überzogene und unnötige Zellen (in der Regel 1.04 oder 1:5 Verdünnung), für 2 Platten bei 1.05 zB, entfernen Sie 600 ul, dann fügen Sie 1,6 ml frisches Medium. </li><li> Entfernen Matrigel von Platten. Platz Zellen durch tropfenweise verteilen gleichmäßig auf der Platte. Vermeiden Sie Schütteln der Röhre übermäßig, da dies dazu führen, Zellen in Richtung Zentrum bewegen. </li><li> Waschen Rohr mit 1 ml Medium und Kluft zwischen den Platten. Das endgültige Volumen in jeder Platte sollte 1,5 -2 ml betragen. </li><li> Ändern Medium jeden Tag, außer für den Tag nach Passagieren. Obwohl esideal, um das Medium täglich ändern, kann dies gelegentlich bei einer Frequenz von einmal alle zwei Tage gewechselt werden, wenn nicht mehr als 2-3 Tage seit dem letzten Durchgang, ohne die Pluripotenz oder Differenzierungspotentials bestanden haben. </li><li> Wenn die Zelllinie müssen eingefroren werden, statt erneut zu suspendieren in 1-2 ml mFreSR Einfrieren Medium unter Verwendung einer 2 ml Pipette und Platz 1 ml / cryovial. Platz in einem Fläschchen Gefriertruhen bei -80 ° C und Transfer zum flüssigen Stickstoff in 3-4 Tagen. </li></ol> Hinweis: Die manuelle Mikrodissektion von iPS-Zellen müssen unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden. Ein in-vitro-Fertilisation (IVF) Arbeitsstation (zB eine IVF Workstation aus KSystem) mit einem Stereomikroskop integriert ermöglicht Manipulation der Zellen unter sterilen Bedingungen während sie auf einer erhitzten Oberfläche gehalten werden. Wenn diese nicht vorhanden, kann ein Stereomikroskop nach einem regelmäßigen Laminarströmungshaube bewegt werden. 2. Embryoidkörpern Aggregation und Cardiac induction <ol><li> Bereiten EBM-20 Medium gemäß der folgenden Tabelle. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> Endkonz. </td><td> Für 500 ml </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (Herkunft Südamerika) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> MEM nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicillin - Streptomycin </td><td> 100U/ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> 50 &amp;mgr; M </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Verwendung von FBS Südamerikas Herkunft ist entscheidend für die Bestimmung der Differenzierung Effizienz: Beschäftigung von anderen Arten von sera beeinflussen könnendie Differenzierung. Um eine vollständige EBM-20, Add Ascorbinsäure (AA) auf eine Endkonzentration von 50 ug / ml vorbereiten. Komplettem Wachstumsmedium kann bei 4 ° C für nicht länger als eine Woche gelagert werden. </li><li> Ernte iPS Kolonien wie oben (Schritte 1.6 bis 1.9) beschrieben. </li><li> Resuspendieren vorsichtig in 1 ml EBM-20 mit einer 2 ml Pipette. Vermeiden Aufbrechen Klumpen zu viel - und Abpipettieren nicht mehr als 2-3x, die Überprüfung der Größe der Kolonien unter dem Stereomikroskop. Platte auf ultra-low Befestigungsplatten im Verhältnis 1:1 (zB für eine 35 mm-Schale, verwenden Sie 1 Well einer 6-Well-Platte). Spülen Rohr mit 1 ml EBM-20 und in den Teller. </li></ol> Anmerkung: Die Größe der Kolonien auf die Differenzierung, die Steuerung der Effizienz und Timing der kardialen Induktion. Aggregation von homogen große EBs wurde gezeigt, dass die Variabilität während der Differenzierung beobachtet reduzieren. <ol start="4"><li> Am 3. Tag, EBM-20 einmal zu ändern mit Hilfe eines Mikroskops zu vermeiden erneutfernung von EBs. Halten Pipette nahe der Plattenkante und entfernen Medium. </li><li> Am Tag 7, Schalter EBs Platten mit 0,1% Gelatine und zuvor bei 37 ° C für 30 Minuten platziert beschichtet. Falls erforderlich, können Gelatine entfernt, und die Platten ließ unter einer Zellkultur Haube O / N. In 35-40 EK pro 35 mm-Schale. </li><li> Prüfen EBs für den Sieg gegen Gebiete und Änderung EBM-20 zweimal pro Woche. Markieren Sie heraus, wo schlagen Bereichen sind auf der Oberseite der Schale Abdeckung, um sie unter dem Stereomikroskop Lokalisierung zu erleichtern. Öffentlicher Bereiche sollten nach etwa 10-20 Tagen erscheinen. </li><li> Als Gebiete mit spontanen Kontraktion erscheinen, schalten mittel-bis EBM-2 (Vorbereitung als EBM-20, mit 2% FBS statt) und isolieren sie wie unten beschrieben in Abschnitt 3. </li><li> Weiter auf andere Bereiche für das Schlagen und ändern Medium zweimal pro Woche bis gegen Bereiche für weitere Experimente nötig sind, zu überprüfen. </li></ol> Hinweis: Wirkungsgrad der Differenzierung ist stark abhängig vonmehreren Faktoren ab, sind die kritischen wobei bestimmte Zelllinien und der Ansatz von Serum verwendet, um Herz-Differenzierung zu induzieren. Um die höchste Effizienz zu erzielen, Test Zelllinien für kardiomyogenen Potential und verschiedenen Chargen von Serum. 3. Beating Bereiche Isolation und Kultur <ol><li> Coat 12-Well-Platten (4 cm 2 Fläche) oder die Platten von Interesse mit 5 ug / cm 2 Fibronektin, in PBS verdünnt, um genügend Volumen, um die gesamte Fläche vollständig abdecken (300 ul insgesamt pro Well in 12-Well-Platten) zu machen. Halten aufgedeckt in Zellkultur Kapuze und trocknen lassen. Die Platten können gewickelt und bei 4 ° CO / N. </li><li> Entfernen schlagen Bereich mit einem Glas gezogen Pasteur Pipette und Skalpell, je nach Bedarf. Übertragen auf Fibronectin-beschichteten Platten mit einer 1 ml Pipette. </li><li> 1 ml EBM-2. </li><li> Überqueren Sie die Platte, um die Bereiche, in denen Zellen wurden entfernt angeben und ändern Sie das Medium. Die Platten können gehalten werden bis zu 1 Monat, wie andere Bereiche b beginnen kannessen später. </li></ol> Hinweis: Wenn kleinere Klumpen schlagen benötigt werden, Pipette die explantierten Bereich nach oben und unten mehrmals unter dem Stereomikroskop, bis es in kleinere Stücke bricht. Dies wird in Gruppen von ein paar Schläge Zellen (siehe Film 3) führen. <ol start="5"><li> Ändern Medium zweimal pro Woche bis bereit für die Analysen. </li></ol> Hinweis: Kardiomyozyten aus diesem Protokoll erhaltenen besitzen fetalen wie morphologische und funktionelle Eigenschaften; Reifung gegenüber einem Erwachsenen-ähnlichen Phänotyp kann durch Erhöhen der Zeit in Kultur weiter differenzieren diese Zellen erhalten werden. 4. Einzel-Beating Cells Isolierung und Analyse <ol><li> Coat 2-Kammer-Objektträgern (4 cm 2 Fläche) oder andere geeignete Träger mit 5 ug / cm 2 Fibronektin in ausreichender PBS verdünnt, um die gesamte Kultur bedecken. Wenn ein Glasträger dient, Mantel mit Laminin und Fibronektin (5 ug / cm &lt;sup&gt; je 2). </li><li> Entfernen Sie schlagen mit einer Pasteurpipette / Skalpell von den Platten aus dem Abschnitt 3. </li><li> Verwendung einer 1 ml abpipettiert, Zellen in ein 15 ml Röhrchen mit 500 ul Collagenase II (480 U / ml in PBS mit Mg und Ca), Inkubation 15 min bei 37 ° C und schüttelt das Rohr einmal während der Inkubation. </li><li> Pipette nach oben und unten mit einer 200 ul Pipette. Wenn irgendwelche Klumpen bleiben, an die frische Collagenase II übertragen und wiederholen Sie Schritt 4.3. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4,4 bis keine großen Klumpen übrig sind. </li><li> Inactivate Kollagenase mit 3 ml EBM-2 (kein AA). Das Rohr kann dann unter der Haube in einem beheizten Rack belassen werden, bis andere Rohre bereit sind. Zentrifuge bei 1.000 rcf für 4 min. </li><li> Pellet in 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (verdünnt aus einer 0,5%-Lager in 1X PBS) und bei 37 ° C inkubieren für 5 min. Kombinieren Fraktionen Aufschlüsse aus dem gleichen ursprünglichen Probe. </li><li> Trypsin inaktivieren mit 4 ml EBM-2 (kein AA). Pass-Zellen durch eine 18G Nadel auf einer 2,5-ml-Spritze nicht mehr than 7x. Zentrifuge bei 1.000 rcf für 4 min. </li><li> Zellpellet in 1 ml EBM-2 pro Well und Platte. Zellen können zur funktionellen und morphologischen Analysen 2-3 Tage nach der Beschichtung verwendet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. 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Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

Keine finanziellen Interessen offen zu legen.

Pluripotenten Stammzellen haben das Potenzial, spontan differenzieren sich in CMs, wenn auch mit geringer Effizienz und hohe Variabilität zwischen Linien. Die Entwicklung neuer Induktion Methoden wurde deshalb zur Verbesserung der Effizienz des Verfahrens und der sich in Richtung mehr definierten Protokollen konzentriert. Allerdings sind die meisten dieser neuen Differenzierungsmethoden ziemlich komplex und erfordert aufwendige Kulturbedingungen Feinsteuerung der Zeitpunkt und die Konzentration der Reagenzien, und die ...

Historisch gesehen hat die Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen, die menschliche Entwicklung und die Krankheit auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodellen basiert. Allerdings scheitern zahlreichen menschlichen Phänotypen bei Mäusen erfolgreich repliziert werden, vor allem wegen der biologischen Unterschiede zwischen den beiden Arten. Auf der anderen Seite, zu menschlichen Geweben zugreifen kann begrenzt werden und oft nicht genügend Material für eingehende experimentelle Untersuchungen erhalten werden. Das Gebiet der Herz-Kreislauf-Biologie leidet unter diesen beiden Einschränkungen: die Physiologie des menschlichen Herzens ist signifikant verschieden von der Maus, und eine beträchtliche Menge von Herzgewebe ist nur post-mortem oder während einer Herzoperation. Das Finden einer optimalen Quelle für die Differenzierung von funktionellen humanen CMS hat deshalb zu einem zentralen Thema in der Herz-Kreislauf-Biologie und viel Anstrengung wurde unternommen, um dieses Problem zu beheben. Verschiedene Zelltypen wurden vorgeschlagen, including Skelettmyoblasten, lokalen kardialen Stammzellen, Knochenmark mononukleären Zellen, Endothelzellen Vorläuferzellen und mesenchymalen Stammzellen. Allerdings erhaltenen Daten unter Verwendung dieser Zellen noch nicht durchgängig 4. Die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen (ESC) und die ersten 5 bahnbrechende Entdeckung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka und Thomson 6,7 später schien Lösungen: Diese Zellen haben die Fähigkeit, unbegrenzt zu wachsen und das Potenzial zu geben steigen, um alle Zellen Derivate der drei Keimblätter, einschließlich der CMs. Die Verwendung von IPS-Zellen bietet weitere Vorteile: ist aus autologen adulten Zellen abgeleitet, tragen sie die gleichen Genom des Individuums oder Patienten, aus denen sie abgeleitet sind. Sie ermöglichen damit die Entwicklung von in-vitro-Modelle, die die Untersuchung von menschlichen genetischen Erkrankungen und Mechanismen der Entwicklung zu erleichtern. Auf Grund dieser Eigenschaft können iPS-Zellen auch overcome Probleme im Zusammenhang mit Immunabwehr und ethische Fragen 8. Aus diesen Gründen, obwohl WSR noch den Goldstandard im Bereich der Stammzellbiologie darstellen, sind Forscher weltweit nun mehr bewegen zu iPS-Technologie. iPS-Zellen werden nun verwendet werden, um menschliche Krankheiten in vitro-Modell für verschiedene Bedingungen, einschließlich angeborenen Herz-Kreislaufstörungen 9,10. Vor kurzem hat Anwendung von iPS-Zellen Krankheit Modellierung für monogenic Herzerkrankungen (dh Long-QT-Syndrome, katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie) und Pathologien, bei denen Herzfehler sind Teil eines komplexen Phänotyp (dh Leopard und Timothy-Syndrom, dilatative Kardiomyopathie) durchgeführt. Diese Berichte bestätigt, dass Patienten-spezifischen iPS-Zellen, die in CMs differenziert werden ähnliche phänotypische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, wie die Krankheit in vivo. Allerdings gibtsind noch viele Herausforderungen, um die Wirksamkeit zu induzieren die iPS-Zellen in das Herz-Linie zu verbessern. Spontane Generation von CMS aus menschlichen WSR über Aggregatbildung genannt Embryoidkörpern (EVG) haben erfolgreich 17 bewährt. Seit dieser Entdeckung wurden viele andere Methoden vorgeschlagen worden. Viele Gruppen haben sich die Effizienz der Differenzierung Protokoll weiterentwickelt und haben zu chemisch definierten und Tier-product-freie Kultur Reagenzien bewegt (siehe Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) für eine umfassende Überprüfung aller bestehenden Methoden 3 ). Dennoch ist die klassische Methode auf EB Aggregation basiert immer noch das am häufigsten für die Durchführung funktionelle Studien und Erforschung von Krankheiten Mechanismen eingesetzt. Unsere vorgeschlagene Protokoll basiert auf der Aggregation von iPS-Zellen in EBs und Kultur in Gegenwart von Serum und Ascorbinsäure, die gezeigt wurde, dass die kardiale Differenzierung Prozess zu verbessern und po Basissitively Auswirkungen auf die Reifung dieser Zellen 18,19. In diesem Artikel werden wir durch diese Methodik im Detail zu gehen und zeigen, wie Feeder-freie iPS-Zelllinien zur Erzeugung von Patienten-spezifischen iPS-abgeleiteten CMs verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

Um die Ereignisse Antreiben Entwicklung des Herzens zu untersuchen und um die molekularen Mechanismen, die zu myokardialen Erkrankungen beim Menschen zu bestimmen, ist es wichtig, erste funktionalen humanen Kardiomyozyten (CMS) zu erzeugen. Die Verwendung dieser Zellen in der Wirkstoffforschung und toxikologischen Studien wäre auch sehr vorteilhaft, so dass neue pharmakologische Moleküle zur Behandlung von Herzerkrankungen vor, klinisch Zellen menschlichen Ursprungs validiert werden. Von den möglichen Quellen der CMs sind induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu den vielversprechendsten, da sie direkt aus leicht zugänglichen Patientengewebe abgeleitet werden und besitzen eine intrinsische Fähigkeit, die zu allen Zelltypen des Körpers 1 zu geben. Mehrere Methoden zur Differenzierung iPS-Zellen in CMs vorgeschlagen worden, angefangen von der klassischen Embryoidkörpern (EVG) Aggregation Ansatz zur chemisch definierten Protokollen 2,3. In diesem Artikel werden wir vorschlagen, ein EBS-basiertes Protokoll und zeigen, wie diese method eingesetzt werden, um effizient zu erzeugen funktionale CM-Zellen aus Feeder-freie iPS-Zellen werden.

In unseren Studien haben wir erzeugt CMs aus mehreren iPS-Zelllinien. Diese Linien wurden zunächst auf einem MEF Feeder-Schicht erzeugt, sondern wurden sofort auf Matrigel platziert mit einem definierten Medium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Verschiedene Tests wurden verwendet, um die Wartung der morphologischen Eigenschaften, die Expression von Markern typisch für pluripotente Zellen (OCT-4, SSEA4 und TRA1-60) und ihre Stabilität des Genoms (Abbildung 1) zu überprüfen. <p class="jove_conten...

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Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K Aufrufe.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Serie: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Forschung

Biologie

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.

Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Charakterisierung von Oberflächenantigenen und Proliferationsfähigkeit in hiPSC-treibenden MSCs

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei iPSCs und der Erforschung genetischer Krankheiten 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...