Diese Methode ermöglicht es Personen ohne Elektronikkenntnisse, Instrumente wie dieses Fluorimeter für die isotherme Nukleinsäureamplifikation und -detektion zu bauen, was für die molekulare Diagnostik von entscheidender Bedeutung ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das System zu geringen Kosten vollständig aus kommerziell erhältlichen Materialien und Open-Source-Software zusammengesetzt werden kann. Dieses Fluorimeter kann mit mehreren isothermen Amplifikationsmethoden verwendet werden.
Dies ist wichtig, da isotherme Amplifikationsmethoden zunehmend eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Infektions- und Erbkrankheiten nachzuweisen. Um das optische Gehäuse zu montieren, legen Sie einen 3/16 Zoll langen 4-40-Gewindeeinsatz in das Loch oben auf dem unteren STL-Stück des Optikgehäuses und legen Sie einen 1/4 Zoll langen 4-40-Gewindeeinsatz in alle anderen Löcher des Stücks. Setzen Sie die mittlere Testplatine in den oberen Hohlraum des Gehäuses ein, wobei die fünf Stifte nach oben gerichtet und der Mittelachse des Geräts am nächsten sind, und befestigen Sie die Testplatine mit einer 3/16 Zoll langen 4-40-Schraube.
Platzieren Sie eines der 20-Millimeter-Brennweitenobjektive in den Abschnitt unterhalb der mittleren Testplatine mit der konvexen Seite zur Unterseite des Geräts und weg von der Testplatine. Um die erste Konfiguration zu erstellen, platzieren Sie den Langpassfilter im nächsten Abschnitt unterhalb des 20-Millimeter-Brennweitenobjektivs. Um die zweite Konfiguration zu erstellen, legen Sie zwei gelbe Emissionsfilterfolien in den Abschnitt unterhalb der Linse.
Um die erste Konfiguration zu erstellen, platzieren Sie den dichroitischen Spiegel in den diagonalen Abschnitt in der Nähe der Mitte der Ummantelung, während Sie die vom Hersteller angegebene Filterorientierung beachten. Um die zweite Konfiguration zu erstellen, platzieren Sie den Balkenteiler in den diagonalen Schnitt. Legen Sie je nach Konfiguration eine zweite 20-Millimeter-Brennweitenlinse in den Abschnitt unterhalb des dichroitischen Spiegels oder Strahlteilters, wobei die konvexe Seite zur Oberseite des Geräts zeigt.
Um die erste Konfiguration zu erstellen, platzieren Sie den Anregungsfilter in dem Abschnitt rechts neben dem dichroitischen Spiegel und stellen Sie sicher, dass der Pfeil auf den dichroitischen Spiegel zeigt. Um die zweite Konfiguration zu erstellen, legen Sie eine blaue Anregungsfilterfolie in den Abschnitt rechts neben dem Strahlteiler. Platzieren Sie die 15-Millimeter-Brennweitenlinse rechts neben dem Anregungsfilter mit der konvexen Seite dem dichroitischen Spiegel zugewandt.
Und platzieren Sie eine LED in den verbleibenden Abschnitt des Drucks, wobei die LED je nach Konfiguration zum dichroitischen Spiegel oder Strahlteiler zeigt. Stellen Sie sicher, dass die beiden Drähte, die von der LED führen, in die Aussparungskanäle eingeführt sind, damit der Druck fest schließt. Und wiederholen Sie das Setup für die andere Seite des 3D-Druckstücks.
Legen Sie dann die extrudierten Teile der oberen Hälfte der Ummantelung in die versenkten Rillen der unteren Hälfte der Ummantelung, um die leere Seite des Stücks mit den optischen Komponenten zu schließen. Und befestigen Sie die Teile zusammen mit 3/8 Zoll langen 4-40 Schrauben. Um die Elektronik und den Touchscreen zusammenzubauen, schließen Sie die beiden Mini-Steckplatinen an und platzieren Sie den Mikrocontroller in einem der Steckplatinen, um sicherzustellen, dass der Micro-USB-Anschluss des Mikrocontrollers nach außen zeigt.
Um die LED-Modulation anzuschließen, verbinden Sie den CTL-Pin des LED+Treibers mit einem digitalen Pin des Mikrocontrollers. Und der LED-Pin des LED-Treibers an einen GND-Pin des Mikrocontrollers. Entfernen Sie die Kunststoffabdeckungen auf der Rückseite der Steckplatinen und drücken Sie die Kleberückseite der Steckplatinen auf das 3D-gedruckte Teil, um die kombinierten Steckbretter an der Innenseite des hinteren Teils des STL-gedruckten Teils des LCD-Bildschirmhalters zu befestigen.
Befestigen Sie den LCD-Bildschirmhalter mit den montierten Steckplatinen im optischen Gehäuse mit 1 Zoll langen 4-40 Schrauben. Um das LED-Netzteil anzuschließen, verbinden Sie den LED-Positiven-Pin des LED-Treibers mit dem positiven Draht der ersten LED. Und verbinden Sie den negativen Draht der ersten LED mit dem positiven Draht der zweiten LED auf der Steckplatine.
Verbinden Sie den negativen Draht der zweiten LED mit dem LED-Pin des LED-Treibers. Um das LED-Netzteil anzuschließen, verwenden Sie einen Barrel-Jack-to-2-Pin-Adapter, um die positiven und negativen Drähte des 10-Volt-Netzteils mit den VIN+- bzw. VIN-Pins des LED-Treibers zu verbinden. Um die Stromversorgung und Datenübertragung der Sensortestplatine anzuschließen, verwenden Sie ein 4-poliges Überbrückungskabel, um die SCK-, SDA-, VDUT- und GND-Pins auf den Light-to-Digital-Sensor-Testplatinen durch den Spalt oben rechts im LCD-Halterdruck mit der Mini-Steckplatine zu verbinden.
Vergewissern Sie sich auf der Steckplatine, dass der 3,3-Volt-Pin des Mikrocontrollers und der VDUT-Pin beider Testplatinen, der GND-Pin des Mikrocontrollers und der GND-Pin beider Testplatinen, der analoge 4-Pin des Mikrocontrollers und der SDA-Pin beider Testplatinen sowie der analoge 5-Pin des Mikrocontrollers , und der SCK-Pin beider Testplatinen sind alle angeschlossen. Verwenden Sie vier M2.5-Schrauben, um den Einplatinencomputer auf dem LCD-Bildschirmhalter zu befestigen, wobei die HDMI- und Netzteilanschlüsse des Einplatinencomputers nach oben gerichtet sind und der Einplatinencomputer auf dem 3D-gedruckten Teil zentriert ist. Schließen Sie dann das Touchscreen-Display gemäß den Touchscreen-Anweisungen an den Single Board Computer an.
Und schließen Sie den HDMI-Anschluss des Einplatinencomputers an den HDMI-Anschluss des Touchscreens an. Um die Echtzeit-Fluoreszenzdaten aufzuzeichnen, schalten Sie den Einplatinencomputer ein, nachdem der Wärmeblock eingeschaltet wurde und die entsprechende Temperatur erreicht hat, und verwenden Sie ein Micro-USB-zu-USB-Kabel, um den Einplatinencomputer mit dem Mikrocontroller zu verbinden. Öffnen Sie das bereitgestellte Python-Skript auf dem Touchscreen und ändern Sie die Messzeit.
Ändern Sie den Pfad der variablen Ausgabedatei in den Namen der Datendatei, die das Programm generiert. Und ändern Sie die Variablen der seriellen Schnittstelle auf die gewünschten Werte. Legen Sie zwei PCR-Röhrchen mit den zu überwachenden Reaktionen in den Wärmeblock.
Und legen Sie das Fluorimeter auf den Wärmeblock, wobei die PCR-Röhrchen zwischen den vier Stiften zentriert sind, die aus jedem optischen Kanal extrudieren. Nachdem Sie bestätigt haben, dass das 3D-gedruckte Fluorimeter angeschlossen ist, schließen Sie das Netzteil für die LEDs an und starten Sie das Python-Programm. Auf dem LCD-Bildschirm erscheint eine grafische Benutzeroberfläche zur Messung der Echtzeitfluoreszenz in beiden PCR-Röhrchen.
Zeigen Sie am Ende des Experiments die Messungen und die Ausgabedatendateien an, die am benutzerdefinierten Speicherort gespeichert sind. Nach der Montage kann die Fluorimeterleistung durch Messung der Fluoreszenz aus einer Verdünnungsserie von FITC-Farbstoffen validiert werden. In dieser repräsentativen Analyse zeigten beide Kanäle des Fluorimeters eine lineare Reaktion über den gewünschten Bereich.
Hier sind die Baseline-subtrahierte Fluoreszenz der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation positiv und die negativen Kontrollreaktionen eines handelsüblichen Standard-Kits, gemessen an der zweiten Konfiguration des Fluorimeters. Echtzeit-Fluoreszenzmessungen einer benutzerdefinierten reverse transkriptionsschleifenvermittelten isothermen Amplifikationsreaktion für SARS-COVID-2-RNA an der ersten Konfiguration des Fluorimeters zeigen, dass die Amplifikation wie erwartet über einen klinisch relevanten Bereich von RNA-Kopienzahlen erfolgt. In einer Zeit, in der globale Lieferketten sehr gestresst sind, können Open-Source-Geräte wie dieses Fluorimeter uns helfen, einige der gesundheitlichen Ungleichheiten zu reduzieren, die mit der Pandemie verbunden sind.
