Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Populationsheterogenität durch die morphologische Bewertung der Zellen zu beantworten. Die In-situ-Mikroskopie ermöglicht Studienbedingungen, Prozesserträge und Produktqualität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine In-situ-Messung, die Echtzeitdaten liefert, ohne Probenahme oder Kontaminationsgefahr.
Die an die automatisierte Bilderkennung gekoppelte In-situ-Mikroskopie kann zusätzliche Informationen über Zellstrukturen, Form und Zellagglomeration über die Größe hinaus liefern. Es ist auch möglich, Zellkonzentrationen zu messen. Die Methode hat sich als zuverlässiges Werkzeug erwiesen.
Keine alternative Methode liefert die gleichen Informationen in so kurzer Zeit und geringen Aufwand für die Probenvorbereitung. Die Methode wurde an verschiedene Bioprozesse und Mikroorganismen, SEG-Filamentpilze, Mikroallergien und Hefe angepasst. Die Sonde wird in Verbindung mit einem Computer verwendet.
Die Hardware besteht aus einer einzigen Stabsonde mit einer hochauflösenden CCD-Kamera. Zellen, die einen einstellbaren Messspalt durchlaufen, werden von der Kamera ababgebildet. Licht dringt in die Lücke gegenüber der Kamera ein, was bedeutet, dass die Beleuchtung durch Übertragung erfolgt.
Legen Sie die Hardwareparameter mithilfe von Zellenkonzentrationen fest, die den erwarteten Bereich umfassen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für Offline-Messungen. Verwenden Sie ein Dickenmessgerät, um den Messspalt anzupassen.
Drehen Sie dann die Sondenschneckenmutter, um den Messspalt auf das Fünf- oder Zehnfache des maximal erwarteten Zelldurchmessers einzustellen. Öffnen Sie am Computer die Prüfpunktsteuerungssoftware. Wählen Sie in der Software die gewünschte Sonde aus und gehen Sie zu Abschnittsaktionen.
Drücken Sie dann Connect. Gehen Sie als Nächstes zur Registerkarte Probesteuerung und öffnen Sie sie. Starten Sie das Videostreaming, indem Sie die Wiedergabetaste drücken.
Befestigen Sie die Sonde an einem Stativ, und führen Sie die folgenden Schritte für jede Messung aus. Arbeiten Sie mit der Sonde und sprühen Sie Ethanol in den Messspalt. Wischen Sie Staub oder Schmutz vorsichtig mit optischem Papier ab.
Verwenden Sie am Computer die Live-Ansicht, um zu überprüfen, ob das Glas des Sensors frei von Partikeln ist. Legen Sie als Nächstes ein trockenes optisches Papier in den Messspalt, um es zu fokussieren. Drehen Sie die Bindungsschraube, um den Fokus manuell zu bewegen.
Hören Sie auf zu fokussieren, wenn einzelne Fasern des Papiers im Messabstand deutlich zu sehen sind. Jetzt, bekommen Sie eine Röhre mit Kulturbrühe gefüllt. Tauchen Sie das Mikroskop in die Brühe, so dass der Spalt vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist.
Verwenden Sie die Bindungsschrauben, um den Fokus auf die Zellen zu optimieren. Sobald diese Fokussierung abgeschlossen ist, ändern Sie sie während des Experiments nicht mehr. Kehren Sie zur Software für das Experiment zurück.
Wechseln Sie zum Menü Auslösen. Legen Sie im Menü Auslösen die Bildrate fest. Für Offline-Messungen wird ein Hertz empfohlen.
Gehen Sie von dort aus zum Feld Frames pro Trigger und legen Sie es als notwendig für gute Statistiken fest. Hier etwa 200. Gehen Sie auch zum Menü Allgemein.
Wählen Sie dort das Verzeichnis aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Beginnen Sie mit der Schaltfläche Bildtriggererfassung starten. Bewegen Sie das Rohr vorsichtig, um den Durchfluss im Messspalt zu induzieren.
Verwenden Sie die Bilder aus dem ersten Versuch des Experiments als Trainingssatz. Haben Sie die Open-Source-Software Fidschi bereit und lassen Sie die Bilder aus dem Experiment in sein Fenster. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Analysieren, gefolgt von Tools und dann ROI Manager aus.
Wählen Sie als Nächstes ein Auswahlwerkzeug aus. Entscheiden Sie im Bild für ein Zunotenelement, das im Fokus steht. Zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug einen Kreis um ihn herum.
Drücken Sie Hinzufügen, um die Anmerkung zum ROI Manager hinzuzufügen. Wählen Sie als Nächstes ein Pinselwerkzeug aus, und wählen Sie eine entsprechende Pixelgröße aus. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um die Auswahl zu verfeinern.
Markieren Sie weiterhin alle Objekte von Interesse auf die gleiche Weise auf etwa 15 Bilder. Speichern Sie die annotierten Dateien, und verwenden Sie sie als Trainingssatz. Wenn der Erkennungsalgorithmus trainiert und bereit ist, verwenden Sie ihn, um Ergebnisse zu visualisieren.
Wechseln Sie im Ergebnisanalyser zu Datei, gefolgt von Datei importieren. Wählen Sie dort die gewünschte Ergebnisdatei aus. Fahren Sie fort, indem Sie die Schaltfläche Diagramm erstellen drücken.
Wählen Sie Verteilungsdiagramm aus. Dies zeigt die morphologische Verteilung der Kultur. Kehren Sie zum Diagramm erstellen zurück, um Sensitivitätsdiagramm auszuwählen.
Anhand der angezeigten Informationen kann bestimmt werden, wie viele Zellen analysiert werden müssen, um die gewünschte Genauigkeit zu erhalten. Führen Sie Online-Messungen durch, nachdem Sie Offline-Messungen abgeschlossen haben. Für Online-Messungen können Sie die Sonde direkt an einen Bioreaktor anschließen.
Nach dem Anschluss die Baugruppe richtig sterilisieren. Wählen Sie Überwachung im Dashboard aus. Es gibt eine Wiedergabe-Taste, um die Bildaufnahme zu starten, und eine Stopp-Taste, um sie zu beenden.
Drücken Sie die Wiedergabetaste. Am Bioreaktor beginnen die Impfung der Kultur. Die Kamera erfasst Videos der Zellen und identifiziert sie automatisch zur Analyse.
Die Überwachung liefert Online-Daten über Zellgrößen und -formen verschiedener Zellmorphologien während der gesamten Fermentation. Die Echtzeit-Ergebnisse können auf verschiedene Weise formatiert und auch zur weiteren Analyse exportiert werden. Dieses Diagramm der kumulativen Verteilungen des S.Cerevisiae Zelldurchmessers wird aus Daten erstellt, die mit dieser Technik analysiert werden.
Es zeigt, dass die automatische Zellerkennung in der Lage ist, angehende und nicht aufkeimende Zellen zu unterscheiden. Die feste Kurve ist die Verteilung während eines Anbaus bei drei Stunden. Die gepunktete Kurve ist die Verteilung des gleichen Anbaus nach sieben Stunden.
Die gestrichelte Kurve stellt Daten dar, die nach 13 Stunden gesammelt wurden. Die Anmerkungsprozedur ist zeitaufwändig, aber sie ist der Schlüssel, um die gewünschte Genauigkeit für die Zellenidentifikation zu erreichen. Bei diesem Verfahren kann die Echtzeitmessung für die Prozesssteuerung verwendet werden, wenn die Messzeiten kürzer sind als die Prozessdynamik.
Diese Technik ebnet den Weg für die Messung der Populationsheterogenität als Prozessparameter für mikrobielle Kultivierungen von den frühen Prozessentwicklungsschritten bis zur Produktionsskala.
