Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R35GM124868 und von der Duke University unterstützt.

1. setup Layout und Ausrichtung
<ol>
	<li>Laser-Installation und Kollimation der Tracking-Anregung<ol>
		<li>Befestigen Sie den Laser auf die optischen Tisch mit einer selbstgebauten Halterung. Die Halterung ist eine einfache Aluminium-Platte mit Befestigungsbohrungen für den Laserkopf und optischen Tisch. Der Laser ist fest eine Metallfassung für Stabilität und Wärmeableitung beizufügen. Verwenden Sie für diese Arbeit 488 nm Festkörperlaser für Beleuchtung (Abbildung 1), obwohl die Wellenlänge ausgewählt werden kann, entsprechen einem bestimmten Fluorophore oder experimentieren. Ein kritischer Faktor ist, dass die Wellenlänge des Lasers den 2D-EOD Arbeitsbereich passen bestimmt in erster Linie durch die Wellenlängen-Platte zwischen die zwei Deflektoren (Abbildung 1: W2). 488 nm Laser kann das grüne oder gelbe fluoreszierende Protein (GFP/YFP), die gemeinsame fluoreszierende Tags in live Zellexperimente sind effektiv begeistern.</li>
		<li>Der Laserstrahl Höhe und Richtung mit einer dielektrischen Spiegel anpassen (Abbildung 1: M). Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl ist parallel zum optischen Tisch und auf eine passende Höhe einstellen. Hinweis: Sollte die Höhe anhand der Mikroskop-Plattform gewählt werden. Diese Höhe sollte für alle nachfolgenden Spiegel in diesem Protokoll verwendeten beibehalten werden, obwohl es nicht explizit angegeben werden.</li>
		<li>Lassen Sie den Strahl mit einem Paar Linsen (Abbildung 1: L1 und L2). Die Brennweiten der Linsen sollte sorgfältig ausgewählt werden, um den Laserpunkt abgeschnitten durch die Blende von der 2D-EOD zu vermeiden. Clipping ist offensichtlich durch eine Änderung in der Laser-Strahl-Form nach dem Durchlaufen der 2D-EOD. Die Qualität der Kollimation hier ist sehr wichtig, weil Aberrationen durch nachfolgende Linsen verstärkt werden und jede Abweichung wird die Leistung der 2D-EOD Durchbiegung verschlechtern. Im Idealfall lassen Sie den Strahl durch Fokussierung des Strahls zu einem Punkt mindestens 20 m entfernt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Legen Sie eine Lochblende (Abbildung 1: PH) der entsprechenden Größe im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse (Abbildung 1: L1).<ol>
		<li>Wählen Sie eine entsprechend dimensionierte Lochkamera. Die Lochkamera Größe kann anhand der folgenden Berechnung gewählt werden: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Wo λ ist die Wellenlänge des Lasers, f ist die Brennweite der ersten Linse, und D ist der Eingang Strahldurchmesser.</li>
		<li>Montieren Sie die Lochkamera auf 3D Verschiebetisch, so dass es gerade im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse platziert werden kann.</li>
		<li>Passen Sie die Position für das Loch. Einen Laser-Leistungsmesser nach der Lochkamera und passen Sie die Position der Lochkamera in XYZ, das macht Zähler auslesen zu maximieren. Wenn ein Beugung Ring beobachtet wird, mit einer Iris platziert, bevor die 2D-EOD blockieren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von Glan-Thompson-Polarisator<ol>
		<li>Setzen Sie den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) nach der zweiten Linse Kollimation (Abbildung 1: L2) um die Polarisation des Laserstrahls zu reinigen. Drehen Sie den Polarisator um maximale Kraftübertragung mit dem Leistungsmesser zu finden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von EOD<ol>
		<li>Verwenden Sie 2 EOD (Abbildung 1: EOD1 &#38; EOD2), den Laser in X- und Y-Richtung abzulenken. Maximieren Sie die Laser-Übertragung durch Anpassen der Gier, Neigung und Höhe des jedem EOD.</li>
		<li>Richten Sie die zwei EODs zueinander mit der Ausrichtung Markierung des Herstellers auf der Seite jedes Deflektor.</li>
		<li>Beantragen Sie ein Testmuster an die Steuerung des 2D-EOD, überprüfen Sie die Ausgabe der EOD. Dies kann der Ritter Tour (Abbildung 2) über die nachfolgend beschriebenen FPGA oder eine einfache Sinuswelle von einem Funktionsgenerator zur Verfügung gestellt. Für eine optimale Leistung sollte der Ablenkung durch jede Deflektor parallel zur X oder Y-Richtung des Piezo-Nanopositionierer sein. Diese Richtung wird durch die Winkelrichtung die Deflektoren um die Getriebe-Achse bestimmt. Um die Durchbiegung Richtung drehen ohne bewegliche 2D-EOD, platzieren Sie eine Taube Prism nach 2D-EOD die Durchbiegung Achsen zu den Piezo Nanopositionierer Achsen ausrichten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von Halbwellen-Platte<ol>
		<li>Legen Sie eine Halbwellen-Platte (Abbildung 1: W1) zwischen den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) und 2D-EOD ausrichten den eingehenden Laser beam Polarisation mit den Achsen der Durchbiegung des 2D-EOD. Eine langen Brennweite Objektiv (300 mm) nach der 2D-EOD und eine sCMOS Kamera im Laserfokus. Als nächstes aktivieren Sie die 2D-EOD, der Ritter Tour beschrieben (Abbildung 2) zu generieren. Drehen Sie die Halbwellen Platte, bis eine gleichmäßig quadratische Laser-Verteilung auf die Kamera beobachtet wird.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation eines Balkens Aufwendung Objektiv und Relais-Linse-paar<ol>
		<li>Legen Sie ein paar Linsen (Abbildung 1: L3 und L4) nach der 2D-EOD, erweitern Sie den Balken um die hintere Öffnung der Objektivlinse zu füllen (Abbildung 1: OL) und ein weiteres paar Linsen (Abbildung 1: L5 und L6), Relais der Brennebene auf das Mikroskopobjektiv. Achten Sie darauf, genügend Raum zwischen diesen beiden Paaren von Linsen zu verlassen, wie der TAG Objektiv zwischen ihnen in einem späteren Schritt installiert werden soll.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installieren Sie das dichroitische Filter, 10/90 Strahlteiler, Fokussierung Objektiv, APD, Objektiv und Fluoreszenz Emission Filter zur Vervollständigung den Erkennung Weg.<ol>
		<li>Den dichroitischen Filter einbauen (Abbildung 1: DC) entsprechend den Laser auf das Objektiv. Richten Sie den Laser gehen Sie geradeaus durch das Zentrum der Objektivlinse mit zwei Schwertlilien auf der Ober- und Unterseite von einer langen Objektiv-Tubus.</li>
		<li>Installieren Sie einen 10/90 Strahlteiler (Abbildung 1: BS) durch die 10 % des Lichtes für die Bildgebung durch eine sCMOS Kamera (siehe unten) und 90 % der durchläuft, der APD für Tracking reflektiert wird.</li>
		<li>Richten Sie die APD. Fokussieren Sie den Laser auf einem Deckgläschen durch das Objektiv. Verwenden Sie die Reflexion aus dem Deckglas, alle nachfolgenden Elemente auszurichten, indem ein Deckglas der Objektive Fokus setzen und überprüfen die Intensität der APD auslesen. Nach den Strahlteiler installieren der APD Fokussierlinse (Abbildung 1: L7) gefolgt von der APD auf einer 3D Übersetzung-Bühne. Positionieren Sie das Objektiv so, dass die Laser-Reflexion aus dem Ziel, durch die Mitte der Linse geht.</li></ol></li></ol>Die APD-Position kann optimiert werden, durch die 3D Position um die Intensität von der Laser-Reflexion auf das Deckglas zu maximieren. Die APD-Position ist an der optimalen Position, wenn eine Bewegung der Detektor Position in eine beliebige Richtung die Intensität verringert.
		<li>Installieren Sie einen Langpass-Fluoreszenz Emission Filter (Abbildung 1: F) vor den Strahlteiler, reflektierte und zerstreute Licht zu entfernen.</li>
	
	
	<li>Installation von der TAG-Linse<ol>
		<li>Legen Sie das TAG Objektiv zwischen den beiden Paaren von Linsen (zwischen Abbildung 1: L4 und L5) so erwähnt und in Abbildung 1dargestellt. Anpassen der Yaw, Pitch, Höhe und Seitenlage derart, dass der Strahl senkrecht durch die Mitte des TAG-Linse geht.</li>
	</ol>
	</li>

2. Probenvorbereitung.
<ol>
	<li>Feste Partikel Vorbereitung<ol>
		<li>Verdünnen Sie 190 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit PBS-Puffer. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckglas und Mount auf dem Probenhalter der piezoelektrischen Bühne hinzufügen (das Volumen der Perlen hängen von der Probenhalter; der Durchmesser der Probenkammer Halter verwendet hier ist 18 mm). Für die hier verwendeten Perlen werden PBS die Partikel auf dem Deckglas zu hinterlegen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Frei bewegliche Teilchen-Vorbereitung<ol>
		<li>Verdünnen Sie 110 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit VE-Wasser. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckgläschen hinzufügen und auf der Probenhalter der piezoelektrischen Stufe montieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimieren Sie Tracking-Parameter
<ol>
	<li>Rasterscan feste Partikel<ol>
		<li>Legen Sie eine feste Partikel Probe am Mikroskop.</li>
		<li>Aktivieren Sie den Laser, Micropositioner Controller, Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD-Controller. Beachten Sie, dass die Reihenfolge nicht ankommt. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im geschlossenen Regelkreis.</li>
		<li>Raster scannen die Probe in XYZ mit einer benutzerdefinierten Scan Software (Abbildung S3, Software, die von den Autoren auf Anfrage erhältlich), das treibt die 2D-EOD in einem Ritter Tour (Abbildung 2), sammelt zählt die APD, treibt die piezo Nanopositionierer, und führt Positionsberechnung (Abbildung S2). Die Schrittweite ist 40 nm und die Tastweite ist 2 µm.<ol>
			<li>Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Nach der Platzierung der Probenmaterials in der Brennebene zurück setzen Sie Fluoreszenz Emission Filter ein.</li>
			<li>Öffnen Sie das Scan-Programm. Stellen Sie Scanbereich und Schrittweite durch Eingabe der Nummer in der "Start", "fertig stellen" und "Schritt ein". Zunächst legen Sie einen großen Scanbereich und Schrittweite, ein Teilchen (z.B. 10 x 10 µm Bereich mit 200 nm Schrittweite) zu finden. Schrumpfen Sie nach der Feststellung der Partikel der Scanbereich und verringern Sie Schrittweite (z.B. 2 x 2 µm Bereich mit 100 nm Schrittweite) zu. Klicken Sie auf "Scan", um führen Sie einen 3D Rasterscan, um den fluoreszierenden Fokus zu finden.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TAG-Objektiv-Einstellungen (siehe auch Abbildung 3)<ol>
		<li>Klicken Sie auf die TAG-Objektiv-Steuerungs-Software. Klicken Sie auf "verbinden", "schalten" sequenziell.</li>
		<li>Um die Ausgangsphase des Trigger-Signals zu ändern, ist es notwendig, ändern Sie den Trigger-Ausgabemodus. Ändern Sie zunächst den Modus von "RGB", "Multiplane" und ändern Sie es zurück. Jetzt kann die Phase geändert (Abb. 3 b).</li>
		<li>Festlegen der Ausgangsphase 0°, 90° und 270 ° sein. Während alle drei Phasen, die den Phasenraum decken verwendet werden können, sind diese drei auch empirisch arbeiten gefunden (Abb. 3 c).</li>
		<li>Wählen Sie die 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung.</li>
		<li>Um die optimale Frequenz zu finden ist es oft notwendig, um den Frequenzbereich Suche ändern. Klicken Sie auf "erweitert", "einstellen". Änderung der ' Max. Freq(Hz) "der Spalte 0 von 70.000 Hz 71.500 Hz. Dies kann eingestellt werden, in welchem Frequenzbereich geeignet ist. Klicken Sie auf "Kalibrierung speichern", "Exit Kalibrierung" (Abbildung 3d).</li>
		<li>Um die neue Kalibrierung wirksam zu machen, wechseln Sie die Resonanz auf eine andere Frequenz (z. B. 189.150 Hz) und wechselte dann zurück zu den 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung (Abbildung 3e).</li>
		<li>Ändern Sie die Amplitude allmählich auf 35 %. Klicken Sie auf "Sperren Resonanz". Nachdem die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf "Entsperren Resonanz" (Abbildung 3e). Das TAG-Objektiv ist nun einsatzbereit.</li>
		<li>Kalibrieren, ändern Sie die Parameter, die bei der Schätzung verwendet werden, um die geschätzte Position gleich der realen Position machen, wie in Abbildung 4e, f. Eingabe der Scanbereich von x, y und z und klicken Sie dann auf "Scan" Taste zum Scannen der Probe in XYZ zu bewegen die Partikel über die beweglichen Laserspot. Die Position des Partikels sollten wie durch Laserfokus gescannt wird mit der geschätzten Partikel Position bestimmt durch die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) übereinstimmen. Die Beziehung zwischen dem geschätzten und echte Position (Abbildung 4D) kann geschätzte Position Bilder (Abb. 4f) entnommen werden. Wenn die Positionen nicht einverstanden sind, passen Sie die Werte der Laserposition (Ck) in die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) verwendet.</li>
		<li>Richten Sie TAG Objektiv<ol>
			<li>Wenn der TAG Objektiv Controller deaktiviert ist, gescannt das Raster Partikelbilder (siehe unten), die vor der Installation TAG Objektiv und nach Installation TAG Objektiv identisch aussehen sollte. Als nächstes führen Sie fluoreszierende Partikel Z-Stapel-Scannen durch verschieben das Ziel mit der Z-Nanopositionierer Tune Position und Winkel der TAG Objektiv (Abbildung 4). Optimieren Sie die Position der Linse TAG bis gibt es kein Drift in den Partikel-Bildern in XY-Ebene entlang der Z-Richtung, die erreicht wird, wenn es keine Änderung in der XY-Position des Partikels in Abhängigkeit von der Z-Position (Abbildung 4D). Das Tracking-System ist nach dem Ausrichten des Objektivs TAG einsatzbereit.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von sCMOS Kamera zur Überwachung der Partikel<ol>
		<li>Installieren Sie eine sCMOS Kamera um Partikel zu visualisieren, während sie verfolgt werden. Installieren Sie die sCMOS erst, nachdem alle Komponenten von der Tracking-System installiert und optimiert haben.</li></ol></li></ol>Laden Sie eine feste fluoreszierende Partikel-Probe auf dem Mikroskop und führen Sie das Tracking-Programm, ein Teilchen in der objektiven fokalen Volumen zu sperren. Installieren Sie dann die 100 mm Brennweite (Abbildung 1: L8) und sCMOS. Einstellen Sie die sCMOS Position, so dass das Bild des Partikels, der kleinsten und hellsten Stelle fokussiert ist.
	
	

(4) in Echtzeit 3D-Tracking von frei diffundierende Nanopartikel
<ol>
	<li>Setzen die 110 nm frei beweglichen Teilchen Probe am Mikroskop.</li>
	<li>Laser, Mikro-Positionierer Controller Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD Controller einschalten. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im Open-Loop. Stellen Sie die TAG Objektiv Software gemäß Schritt 3.2.</li>
	<li>Öffnen Sie, und führen Sie die Tracking-Software (verfügbar auf Anfrage von den Autoren). Legen Sie die Position Schätzung Parameter auf die optimierten Werte, die in Abschnitt 3 gefunden wurden.</li>
	<li>Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Erhöhen Sie nach der Feststellung des Deckglases die Fokus Position 15 µm Laser entfernt das Deckglas und in die Lösung zu konzentrieren. Fluoreszenz Emission Filter wieder einsetzen.</li>
	<li>Die integrierte Steuerung Konstanten festgelegt. Die integrierte Steuerung Konstanten können eingestellt werden, beginnend bei einem niedrigen Wert und langsam erhöhen, bis die Schwingungen in der Partikel Positionsanzeigen gesehen werden können. Sobald Schwingungen zu beobachten sind, festgelegt die ganzheitliche Steuerung konstanten zu 80 % des Wertes der Schwingungen verursacht. Typische Werte werden um 0,012 für XY "integraler Gain" und 0,004 für Z "integralen Verstärkung".</li>
	<li>Die Tracking-Schwellen in 'Track Schwelle' und "Track Minimum" eingestellt und die Tracking-Experiment starten, indem Sie auf "Suchen" und "Auto Track". Die Schwelle für die abschließenden Verfolgung liegt etwas höher als der Hintergrund-Ebene und die Schwelle zur Auslösung von Tracking ist etwa doppelt so hoch als der Hintergrund. Hier die Schwelle zur Auslösung von Tracking 3 kHz und der Schwellenwert für die Beendigung der Flugbahn ist 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. 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J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Obwohl viele Sorten von 3D Einzelkorn tracking-Methoden in den letzten Jahren entstanden sind, ist robuste Echtzeitverfolgung von high-Speed 3D Diffusion bei niedrigen Photon Zählraten mit einer einfachen Einstellung immer noch eine Herausforderung, die ihre Anwendung auf wichtige biologische Grenzen Probleme. Die 3D-DyPLoT-Methode beschrieben in dieser IP-Adressen diese Herausforderungen in mehrfacher Hinsicht. Erstens sind die Anregung und Erkennung Wege vereinfacht erheblich im Vergleich zu anderen Implementierungen ...

Die Entstehung der modernen bildgebenden Verfahren hat ein Fenster um zu sehen, je mehr detaillierte Struktur der zelluläre Phänomene bis hin zum molekularer Ebene geöffnet. Methoden wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)1,2,3, Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM)4,5,6,7 , strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)8,9,10,11, und stimulierte Emission Depletion-Mikroskopie (STED)12,13, 14 gegangen weit jenseits der Beugungsgrenze, noch nie dagewesene Detail in die Struktur und Funktion von lebenden Zellen zu liefern. Voll zu verstehen, wie diese Systeme Verhalten erfordert jedoch dynamische Informationen sowie Strukturinformationen. Die oben aufgeführten Höchstauflösung Methoden beinhalten einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und zeitlicher Auflösung, Begrenzung der zeitlichen Präzisions mit der dynamische Prozessen sondiert werden können. Eine Methode, die liefert hochpräzise räumliche und zeitliche Auflösung ist RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Wir unterscheiden hier zwischen traditionellen 3D-SPT30 und RT-3D-SPT. Traditional 3D-SPT erfordert lediglich eine Zeitreihe von dreidimensionalen Bilddaten (die entweder mit einem confocal Mikroskop oder einem Epifluoreszenz Mikroskop erworben werden können Angesichts der richtigen Konfiguration). In traditionellen 3D-SPT sind die Koordinaten des Partikels nach der Datenerfassung entschlossen durch Auffinden der Partikel in jedem Bildstapel und die Standorte in aufeinander folgenden Bänden zu verketten, eine Flugbahn zu schaffen. Für diese Methoden ist die ultimative zeitliche Auflösung durch die volumetrische Bildverarbeitung Rate bestimmt. Für konfokale Mikroskope ist dies leicht in der Größenordnung von Sekunden bis zu zehn Sekunden. Für Epifluoreszenz Methoden, wobei der Strahlengang so manipuliert ist, dass die axiale Lage Informationen extrahiert werden kann, ist die zeitliche Auflösung der Kamera Belichtung oder Auslesen zeitlich begrenzt. Diese Epifluorescent-Methoden sind begrenzt im Bereich über dem axiale Informationen gesammelt werden kann, obwohl die jüngsten Fortschritte bei Fourier Flugzeug Phase Masken Design und adaptive Optik weitet diese reicht bis zu 10 µm oder mehr31,32 , 33 , 34.
Im Gegensatz dazu setzt RT-3D-SPT nicht auf einen 3D-Bild Stapel zu erwerben und die Suche nach Partikel nach der Tat. Stattdessen Standort in Echtzeit Informationen über einzelne Punktmelder extrahiert und Feedback werden effektiv "das Teilchen im fokalen Volumen der Objektivlinse durch den Einsatz von piezoelektrischen Bühne Highspeed sperren". Dies ermöglicht kontinuierliche Messung der Position der Partikel begrenzt nur durch wie viele Photonen gesammelt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode spektrale Verhör des Partikels, wie es über große Entfernungen bewegt. RT-3D-SPT Kräfte wirksam funktioniert ähnlich wie eine Kraft-freie optische Falle für nanoskalige Objekte, wobei die Partikel kontinuierlich sondiert und in Echtzeit ohne die Notwendigkeit für große Laserleistungen oder optische gemessen. Angesichts der Tatsache, dass RT-3D-SPT für fortlaufende Befragung schnell diffusiven Objekte (bis zu 20 µm2/s)25,29 in drei Dimensionen bei niedrigen Photon zählen Preise20,29Mittel bietet, 35, es soll ein Fenster in schnell oder vorübergehende biologische Prozesse wie intrazelluläre Frachtverkehr, Ligand-Rezeptor-Bindung und die extrazelluläre Dynamik der einzelnen Virionen. Zu diesem Punkt wurde jedoch die Anwendung der RT-3D-SPT beschränkt sich auf die wenigen Gruppen arbeiten, um diese Technologie zu fördern.
Eine Barriere ist die Komplexität des optischen Layouts erforderlich durch RT-3D-SPT-Methoden, die verschieden sind. Für die meisten Methoden ist die optische Rückmeldung durch einen piezoelektrischen Bühne zur Verfügung gestellt. Wie die Teilchen macht kleine Bewegungen in X, Y oder Z, Anzeigen von Einzelpunkt-Detektoren sind in Fehlerfunktionen konvertiert und gefüttert wiederum drehen bewegt sich auf einem piezoelektrischen Nanopositionierer High-Speed-die Probe, die Partikelbewegung effektiv entgegenzuwirken Sperren sie im Ort bezogen auf das Objektiv. Zur Messung von kleiner positioneller Bewegungen in X, Y und Z, entweder mehrere Detektoren (4 oder 5 je nach Implementierung)15,18,21 oder mehrere Erregung Flecken (2-4, desto geringer die angewendet werden, kann wenn eine Lock-in-Verstärker dient zur extrahieren Sie X und Y-Position mit einer rotierenden laser-spot)25,28 gelten. Die Überlappung dieser mehrere Erkennung und Emission Flecken erschweren die Systeme zu richten und zu pflegen.
Hier präsentieren wir eine High-Speed-Ziel gesperrt 3D-SPT-Methode mit einem vereinfachten optischen Design 3D-DyPLoT29genannt. 3D-DyPLoT verwendet ein 2D-EOD und ein TAG Objektiv36,37,38 , um dynamisch ein fokussierte Laserspot durch das Objektiv Brennweite Volumen mit einer hohen Rate (50 kHz XY, 70 kHz Z) bewegen. Kombination von Laser-Fokus-Position und der Photon-Ankunftszeit ermöglicht 3D Position der Partikel schnell auch bei niedrigen Photon Zählraten eingeholt werden. 2D-EOD treibt Laserfokus eines Ritters Tour Muster39 mit einer quadratischen Größe von 1 x 1 µm in der XY-Ebene und die TAG-Linse bewegt Laserfokus in axialer Richtung mit einer Reichweite von 2-4 µm. Die 3D Partikel-Position wird durch eine optimierte Position Schätzung Algorithmus29,40 in 3D erreicht. Die Kontrolle über das 3D dynamisch bewegten Laser spot, Photon beginnend mit der Lawine Fotodiode (APD), Echtzeit-Partikel Positionsberechnung, piezoelektrische Bühne Feedback und Datenaufzeichnung erfolgt auf einem Feld programmierbare Gate Array (FPGA).In diesem Protokoll haben wir beschrieben, wie Sie Schritt für Schritt, einschließlich der optischen Achse, Kalibrierung mit festen Partikeln, 3D-DyPLoT Mikroskop bauen und endlich frei Particle Tracking. Als eine Demonstration wurden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser für Minuten hintereinander kontinuierlich verfolgt.
Die hier beschriebene Methode ist eine ideale Wahl für alle Anwendungen wo ist es wünschenswert, eine schnell bewegendes fluoreszierende Sonde bei wenig Licht, einschließlich Viren, Nanopartikeln und Vesikel wie Endosomen kontinuierlich zu überwachen. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden gibt es nur eine einzige Anregung und einzelne Erkennung Weg, so dass Ausrichtung und Wartung einfach. Darüber hinaus ermöglicht der großen Erfassungsbereich dieses Mikroskop leicht schnell diffundierende Teilchen, während die Fähigkeit, bei niedrigen Signalpegeln (bis 10 kHz) verfolgen diese Methode ideal für Low-Light Anwendungen29macht abholen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">2D Electro-optic Deflector&#160;</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">M310A</td>
			<td style="width:541px;">2 required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Power supply for EOD</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">412</td>
			<td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TAG&#160; Lens</td>
			<td style="width:145px;">TAG Optics</td>
			<td style="width:160px;">TAG 2.0</td>
			<td>Used to deflect laser along axial direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">XY piezoelectric nanopositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-PDQ275HS</td>
			<td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Z piezoelectric nanoposiitoner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-OP65HS</td>
			<td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Micropositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">MicroDrive</td>
			<td>Used to coarsely position sample and evaluate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Objective Lens</td>
			<td style="width:145px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">PlanApo</td>
			<td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:145px;">PCO</td>
			<td style="width:160px;">pco.edge 4.2</td>
			<td>Used to monitor the particle&#39;s position</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">APD</td>
			<td style="width:145px;">Excelitas</td>
			<td style="width:160px;">SPCM-ARQH-15</td>
			<td>Lower dark counts beneficial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Field programmable gate array</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">NI-7852r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Software</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tracking excitation laser</td>
			<td style="width:145px;">JDSU</td>
			<td style="width:160px;">FCD488-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-150-A-ML</td>
			<td>L1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Pinhole</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">P75S</td>
			<td>PH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Glan-Thompson Polarizer</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">GTH5-A</td>
			<td>GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Half-wave plate</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">WPH05M-488</td>
			<td>WP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-75-A-ML</td>
			<td>L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-250-A-ML</td>
			<td>L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Dichroic Mirror</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>DC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Fluorescence Emission Filter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">D535/40m</td>
			<td>F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">10/90 beamsplitter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">21012</td>
			<td>BS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">190 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/9942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">110 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/10617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Powermeter</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">CMOS</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Iris</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">SM1D12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td style="width:145px;">Mad City Labs</td>
			<td style="width:160px;">RM21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Echtzeit-dreidimensionale Einzelkorn tracking (RT-3D-SPT) hat das Potenzial, schnell, 3D Prozesse in zellulären Systemen beleuchten. Obwohl verschiedene RT-3D-SPT-Methoden in den letzten Jahren vorgeschlagen haben, bleibt high-Speed-tracking 3D diffundierende Teilchen bei niedrigen Photon Zählraten eine Herausforderung. Darüber hinaus sind RT-3D-SPT-Setups in der Regel komplex und schwierig zu implementieren, Begrenzung ihrer weitverbreitete Anwendung auf biologische Probleme. Dieses Protokoll stellt ein RT-3D-SPT-System namens 3D dynamische Photon Lokalisierung Tracking (3D-DyPLoT), die Partikel mit hoher diffusiven Geschwindigkeit (bis zu 20 µm2/s) verfolgen können bei niedrigen Photon Zählraten (bis 10 kHz). 3D-DyPLoT beschäftigt einen 2D elektrooptischen Deflektor (2D-EOD) und eine einstellbaren akustischen Farbverlauf (TAG) Objektiv zu fahren, die eine einzige konzentrierte sich laser-Spot dynamisch in 3D. In Kombination mit einer optimierten Position Schätzung Algorithmus, kann 3D-DyPLoT auf einzelne Partikel mit hoher Verfolgungsgeschwindigkeit und hohe Lokalisierung Präzision sperren. Aufgrund der einheitlichen Erregung und einzelne Erkennung Pfad Layout ist 3D-DyPLoT robust und einfach einzurichten. Dieses Protokoll beschreibt die 3D-DyPLoT Schritt für Schritt aufbauen. Erstens ist das optische Layout beschrieben. Als nächstes wird das System kalibriert und optimiert durch Raster eine 190 nm fluoreszierende Perle mit piezoelektrischen Nanopositionierer scannen. Schließlich, um Echtzeit-3D tracking-Fähigkeit zu demonstrieren, werden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser verfolgt.

Feste Partikel (Abbildung 4) scannen und frei diffundierende 110 nm fluoreszierende Partikel tracking (Abbildung 5) wurden nach der oben genannten Protokolls durchgeführt. Das Teilchen Scannen erfolgte durch den piezoelektrischen Nanopositionierer und bin Photonen bewegen, während gleichzeitig Berechnung des Partikels Position an jedem Punkt im Scan geschätzt. Der Scan Bild zeigt ein Quadrat von sogar Intensität (<strong clas...

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A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Aufrufe.  Duke University. Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Serie: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Forschung

Biotechnik

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Herstellung von Nafion-beschichtet, reduziert Graphene Oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor Monitor pH in Echtzeit während der mikrobiellen Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...