Name: a protocol for real-time 3d single particle tracking
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R35GM124868 und von der Duke University unterstützt.

1. setup Layout und Ausrichtung
<ol>
	<li>Laser-Installation und Kollimation der Tracking-Anregung<ol>
		<li>Befestigen Sie den Laser auf die optischen Tisch mit einer selbstgebauten Halterung. Die Halterung ist eine einfache Aluminium-Platte mit Befestigungsbohrungen für den Laserkopf und optischen Tisch. Der Laser ist fest eine Metallfassung für Stabilität und Wärmeableitung beizufügen. Verwenden Sie für diese Arbeit 488 nm Festkörperlaser für Beleuchtung (Abbildung 1), obwohl die Wellenlänge ausgewählt werden kann, entsprechen einem bestimmten Fluorophore oder experimentieren. Ein kritischer Faktor ist, dass die Wellenlänge des Lasers den 2D-EOD Arbeitsbereich passen bestimmt in erster Linie durch die Wellenlängen-Platte zwischen die zwei Deflektoren (Abbildung 1: W2). 488 nm Laser kann das grüne oder gelbe fluoreszierende Protein (GFP/YFP), die gemeinsame fluoreszierende Tags in live Zellexperimente sind effektiv begeistern.</li>
		<li>Der Laserstrahl Höhe und Richtung mit einer dielektrischen Spiegel anpassen (Abbildung 1: M). Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl ist parallel zum optischen Tisch und auf eine passende Höhe einstellen. Hinweis: Sollte die Höhe anhand der Mikroskop-Plattform gewählt werden. Diese Höhe sollte für alle nachfolgenden Spiegel in diesem Protokoll verwendeten beibehalten werden, obwohl es nicht explizit angegeben werden.</li>
		<li>Lassen Sie den Strahl mit einem Paar Linsen (Abbildung 1: L1 und L2). Die Brennweiten der Linsen sollte sorgfältig ausgewählt werden, um den Laserpunkt abgeschnitten durch die Blende von der 2D-EOD zu vermeiden. Clipping ist offensichtlich durch eine Änderung in der Laser-Strahl-Form nach dem Durchlaufen der 2D-EOD. Die Qualität der Kollimation hier ist sehr wichtig, weil Aberrationen durch nachfolgende Linsen verstärkt werden und jede Abweichung wird die Leistung der 2D-EOD Durchbiegung verschlechtern. Im Idealfall lassen Sie den Strahl durch Fokussierung des Strahls zu einem Punkt mindestens 20 m entfernt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Legen Sie eine Lochblende (Abbildung 1: PH) der entsprechenden Größe im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse (Abbildung 1: L1).<ol>
		<li>Wählen Sie eine entsprechend dimensionierte Lochkamera. Die Lochkamera Größe kann anhand der folgenden Berechnung gewählt werden: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Wo λ ist die Wellenlänge des Lasers, f ist die Brennweite der ersten Linse, und D ist der Eingang Strahldurchmesser.</li>
		<li>Montieren Sie die Lochkamera auf 3D Verschiebetisch, so dass es gerade im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse platziert werden kann.</li>
		<li>Passen Sie die Position für das Loch. Einen Laser-Leistungsmesser nach der Lochkamera und passen Sie die Position der Lochkamera in XYZ, das macht Zähler auslesen zu maximieren. Wenn ein Beugung Ring beobachtet wird, mit einer Iris platziert, bevor die 2D-EOD blockieren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von Glan-Thompson-Polarisator<ol>
		<li>Setzen Sie den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) nach der zweiten Linse Kollimation (Abbildung 1: L2) um die Polarisation des Laserstrahls zu reinigen. Drehen Sie den Polarisator um maximale Kraftübertragung mit dem Leistungsmesser zu finden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von EOD<ol>
		<li>Verwenden Sie 2 EOD (Abbildung 1: EOD1 &#38; EOD2), den Laser in X- und Y-Richtung abzulenken. Maximieren Sie die Laser-Übertragung durch Anpassen der Gier, Neigung und Höhe des jedem EOD.</li>
		<li>Richten Sie die zwei EODs zueinander mit der Ausrichtung Markierung des Herstellers auf der Seite jedes Deflektor.</li>
		<li>Beantragen Sie ein Testmuster an die Steuerung des 2D-EOD, überprüfen Sie die Ausgabe der EOD. Dies kann der Ritter Tour (Abbildung 2) über die nachfolgend beschriebenen FPGA oder eine einfache Sinuswelle von einem Funktionsgenerator zur Verfügung gestellt. Für eine optimale Leistung sollte der Ablenkung durch jede Deflektor parallel zur X oder Y-Richtung des Piezo-Nanopositionierer sein. Diese Richtung wird durch die Winkelrichtung die Deflektoren um die Getriebe-Achse bestimmt. Um die Durchbiegung Richtung drehen ohne bewegliche 2D-EOD, platzieren Sie eine Taube Prism nach 2D-EOD die Durchbiegung Achsen zu den Piezo Nanopositionierer Achsen ausrichten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von Halbwellen-Platte<ol>
		<li>Legen Sie eine Halbwellen-Platte (Abbildung 1: W1) zwischen den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) und 2D-EOD ausrichten den eingehenden Laser beam Polarisation mit den Achsen der Durchbiegung des 2D-EOD. Eine langen Brennweite Objektiv (300 mm) nach der 2D-EOD und eine sCMOS Kamera im Laserfokus. Als nächstes aktivieren Sie die 2D-EOD, der Ritter Tour beschrieben (Abbildung 2) zu generieren. Drehen Sie die Halbwellen Platte, bis eine gleichmäßig quadratische Laser-Verteilung auf die Kamera beobachtet wird.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation eines Balkens Aufwendung Objektiv und Relais-Linse-paar<ol>
		<li>Legen Sie ein paar Linsen (Abbildung 1: L3 und L4) nach der 2D-EOD, erweitern Sie den Balken um die hintere Öffnung der Objektivlinse zu füllen (Abbildung 1: OL) und ein weiteres paar Linsen (Abbildung 1: L5 und L6), Relais der Brennebene auf das Mikroskopobjektiv. Achten Sie darauf, genügend Raum zwischen diesen beiden Paaren von Linsen zu verlassen, wie der TAG Objektiv zwischen ihnen in einem späteren Schritt installiert werden soll.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installieren Sie das dichroitische Filter, 10/90 Strahlteiler, Fokussierung Objektiv, APD, Objektiv und Fluoreszenz Emission Filter zur Vervollständigung den Erkennung Weg.<ol>
		<li>Den dichroitischen Filter einbauen (Abbildung 1: DC) entsprechend den Laser auf das Objektiv. Richten Sie den Laser gehen Sie geradeaus durch das Zentrum der Objektivlinse mit zwei Schwertlilien auf der Ober- und Unterseite von einer langen Objektiv-Tubus.</li>
		<li>Installieren Sie einen 10/90 Strahlteiler (Abbildung 1: BS) durch die 10 % des Lichtes für die Bildgebung durch eine sCMOS Kamera (siehe unten) und 90 % der durchläuft, der APD für Tracking reflektiert wird.</li>
		<li>Richten Sie die APD. Fokussieren Sie den Laser auf einem Deckgläschen durch das Objektiv. Verwenden Sie die Reflexion aus dem Deckglas, alle nachfolgenden Elemente auszurichten, indem ein Deckglas der Objektive Fokus setzen und überprüfen die Intensität der APD auslesen. Nach den Strahlteiler installieren der APD Fokussierlinse (Abbildung 1: L7) gefolgt von der APD auf einer 3D Übersetzung-Bühne. Positionieren Sie das Objektiv so, dass die Laser-Reflexion aus dem Ziel, durch die Mitte der Linse geht.</li></ol></li></ol>Die APD-Position kann optimiert werden, durch die 3D Position um die Intensität von der Laser-Reflexion auf das Deckglas zu maximieren. Die APD-Position ist an der optimalen Position, wenn eine Bewegung der Detektor Position in eine beliebige Richtung die Intensität verringert.
		<li>Installieren Sie einen Langpass-Fluoreszenz Emission Filter (Abbildung 1: F) vor den Strahlteiler, reflektierte und zerstreute Licht zu entfernen.</li>
	
	
	<li>Installation von der TAG-Linse<ol>
		<li>Legen Sie das TAG Objektiv zwischen den beiden Paaren von Linsen (zwischen Abbildung 1: L4 und L5) so erwähnt und in Abbildung 1dargestellt. Anpassen der Yaw, Pitch, Höhe und Seitenlage derart, dass der Strahl senkrecht durch die Mitte des TAG-Linse geht.</li>
	</ol>
	</li>

2. Probenvorbereitung.
<ol>
	<li>Feste Partikel Vorbereitung<ol>
		<li>Verdünnen Sie 190 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit PBS-Puffer. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckglas und Mount auf dem Probenhalter der piezoelektrischen Bühne hinzufügen (das Volumen der Perlen hängen von der Probenhalter; der Durchmesser der Probenkammer Halter verwendet hier ist 18 mm). Für die hier verwendeten Perlen werden PBS die Partikel auf dem Deckglas zu hinterlegen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Frei bewegliche Teilchen-Vorbereitung<ol>
		<li>Verdünnen Sie 110 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit VE-Wasser. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckgläschen hinzufügen und auf der Probenhalter der piezoelektrischen Stufe montieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimieren Sie Tracking-Parameter
<ol>
	<li>Rasterscan feste Partikel<ol>
		<li>Legen Sie eine feste Partikel Probe am Mikroskop.</li>
		<li>Aktivieren Sie den Laser, Micropositioner Controller, Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD-Controller. Beachten Sie, dass die Reihenfolge nicht ankommt. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im geschlossenen Regelkreis.</li>
		<li>Raster scannen die Probe in XYZ mit einer benutzerdefinierten Scan Software (Abbildung S3, Software, die von den Autoren auf Anfrage erhältlich), das treibt die 2D-EOD in einem Ritter Tour (Abbildung 2), sammelt zählt die APD, treibt die piezo Nanopositionierer, und führt Positionsberechnung (Abbildung S2). Die Schrittweite ist 40 nm und die Tastweite ist 2 µm.<ol>
			<li>Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Nach der Platzierung der Probenmaterials in der Brennebene zurück setzen Sie Fluoreszenz Emission Filter ein.</li>
			<li>Öffnen Sie das Scan-Programm. Stellen Sie Scanbereich und Schrittweite durch Eingabe der Nummer in der "Start", "fertig stellen" und "Schritt ein". Zunächst legen Sie einen großen Scanbereich und Schrittweite, ein Teilchen (z.B. 10 x 10 µm Bereich mit 200 nm Schrittweite) zu finden. Schrumpfen Sie nach der Feststellung der Partikel der Scanbereich und verringern Sie Schrittweite (z.B. 2 x 2 µm Bereich mit 100 nm Schrittweite) zu. Klicken Sie auf "Scan", um führen Sie einen 3D Rasterscan, um den fluoreszierenden Fokus zu finden.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TAG-Objektiv-Einstellungen (siehe auch Abbildung 3)<ol>
		<li>Klicken Sie auf die TAG-Objektiv-Steuerungs-Software. Klicken Sie auf "verbinden", "schalten" sequenziell.</li>
		<li>Um die Ausgangsphase des Trigger-Signals zu ändern, ist es notwendig, ändern Sie den Trigger-Ausgabemodus. Ändern Sie zunächst den Modus von "RGB", "Multiplane" und ändern Sie es zurück. Jetzt kann die Phase geändert (Abb. 3 b).</li>
		<li>Festlegen der Ausgangsphase 0°, 90° und 270 ° sein. Während alle drei Phasen, die den Phasenraum decken verwendet werden können, sind diese drei auch empirisch arbeiten gefunden (Abb. 3 c).</li>
		<li>Wählen Sie die 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung.</li>
		<li>Um die optimale Frequenz zu finden ist es oft notwendig, um den Frequenzbereich Suche ändern. Klicken Sie auf "erweitert", "einstellen". Änderung der ' Max. Freq(Hz) "der Spalte 0 von 70.000 Hz 71.500 Hz. Dies kann eingestellt werden, in welchem Frequenzbereich geeignet ist. Klicken Sie auf "Kalibrierung speichern", "Exit Kalibrierung" (Abbildung 3d).</li>
		<li>Um die neue Kalibrierung wirksam zu machen, wechseln Sie die Resonanz auf eine andere Frequenz (z. B. 189.150 Hz) und wechselte dann zurück zu den 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung (Abbildung 3e).</li>
		<li>Ändern Sie die Amplitude allmählich auf 35 %. Klicken Sie auf "Sperren Resonanz". Nachdem die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf "Entsperren Resonanz" (Abbildung 3e). Das TAG-Objektiv ist nun einsatzbereit.</li>
		<li>Kalibrieren, ändern Sie die Parameter, die bei der Schätzung verwendet werden, um die geschätzte Position gleich der realen Position machen, wie in Abbildung 4e, f. Eingabe der Scanbereich von x, y und z und klicken Sie dann auf "Scan" Taste zum Scannen der Probe in XYZ zu bewegen die Partikel über die beweglichen Laserspot. Die Position des Partikels sollten wie durch Laserfokus gescannt wird mit der geschätzten Partikel Position bestimmt durch die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) übereinstimmen. Die Beziehung zwischen dem geschätzten und echte Position (Abbildung 4D) kann geschätzte Position Bilder (Abb. 4f) entnommen werden. Wenn die Positionen nicht einverstanden sind, passen Sie die Werte der Laserposition (Ck) in die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) verwendet.</li>
		<li>Richten Sie TAG Objektiv<ol>
			<li>Wenn der TAG Objektiv Controller deaktiviert ist, gescannt das Raster Partikelbilder (siehe unten), die vor der Installation TAG Objektiv und nach Installation TAG Objektiv identisch aussehen sollte. Als nächstes führen Sie fluoreszierende Partikel Z-Stapel-Scannen durch verschieben das Ziel mit der Z-Nanopositionierer Tune Position und Winkel der TAG Objektiv (Abbildung 4). Optimieren Sie die Position der Linse TAG bis gibt es kein Drift in den Partikel-Bildern in XY-Ebene entlang der Z-Richtung, die erreicht wird, wenn es keine Änderung in der XY-Position des Partikels in Abhängigkeit von der Z-Position (Abbildung 4D). Das Tracking-System ist nach dem Ausrichten des Objektivs TAG einsatzbereit.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation von sCMOS Kamera zur Überwachung der Partikel<ol>
		<li>Installieren Sie eine sCMOS Kamera um Partikel zu visualisieren, während sie verfolgt werden. Installieren Sie die sCMOS erst, nachdem alle Komponenten von der Tracking-System installiert und optimiert haben.</li></ol></li></ol>Laden Sie eine feste fluoreszierende Partikel-Probe auf dem Mikroskop und führen Sie das Tracking-Programm, ein Teilchen in der objektiven fokalen Volumen zu sperren. Installieren Sie dann die 100 mm Brennweite (Abbildung 1: L8) und sCMOS. Einstellen Sie die sCMOS Position, so dass das Bild des Partikels, der kleinsten und hellsten Stelle fokussiert ist.
	
	

(4) in Echtzeit 3D-Tracking von frei diffundierende Nanopartikel
<ol>
	<li>Setzen die 110 nm frei beweglichen Teilchen Probe am Mikroskop.</li>
	<li>Laser, Mikro-Positionierer Controller Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD Controller einschalten. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im Open-Loop. Stellen Sie die TAG Objektiv Software gemäß Schritt 3.2.</li>
	<li>Öffnen Sie, und führen Sie die Tracking-Software (verfügbar auf Anfrage von den Autoren). Legen Sie die Position Schätzung Parameter auf die optimierten Werte, die in Abschnitt 3 gefunden wurden.</li>
	<li>Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Erhöhen Sie nach der Feststellung des Deckglases die Fokus Position 15 µm Laser entfernt das Deckglas und in die Lösung zu konzentrieren. Fluoreszenz Emission Filter wieder einsetzen.</li>
	<li>Die integrierte Steuerung Konstanten festgelegt. Die integrierte Steuerung Konstanten können eingestellt werden, beginnend bei einem niedrigen Wert und langsam erhöhen, bis die Schwingungen in der Partikel Positionsanzeigen gesehen werden können. Sobald Schwingungen zu beobachten sind, festgelegt die ganzheitliche Steuerung konstanten zu 80 % des Wertes der Schwingungen verursacht. Typische Werte werden um 0,012 für XY "integraler Gain" und 0,004 für Z "integralen Verstärkung".</li>
	<li>Die Tracking-Schwellen in 'Track Schwelle' und "Track Minimum" eingestellt und die Tracking-Experiment starten, indem Sie auf "Suchen" und "Auto Track". Die Schwelle für die abschließenden Verfolgung liegt etwas höher als der Hintergrund-Ebene und die Schwelle zur Auslösung von Tracking ist etwa doppelt so hoch als der Hintergrund. Hier die Schwelle zur Auslösung von Tracking 3 kHz und der Schwellenwert für die Beendigung der Flugbahn ist 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Obwohl viele Sorten von 3D Einzelkorn tracking-Methoden in den letzten Jahren entstanden sind, ist robuste Echtzeitverfolgung von high-Speed 3D Diffusion bei niedrigen Photon Zählraten mit einer einfachen Einstellung immer noch eine Herausforderung, die ihre Anwendung auf wichtige biologische Grenzen Probleme. Die 3D-DyPLoT-Methode beschrieben in dieser IP-Adressen diese Herausforderungen in mehrfacher Hinsicht. Erstens sind die Anregung und Erkennung Wege vereinfacht erheblich im Vergleich zu anderen Implementierungen ...

Die Entstehung der modernen bildgebenden Verfahren hat ein Fenster um zu sehen, je mehr detaillierte Struktur der zelluläre Phänomene bis hin zum molekularer Ebene geöffnet. Methoden wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)1,2,3, Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM)4,5,6,7 , strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)8,9,10,11, und stimulierte Emission Depletion-Mikroskopie (STED)12,13, 14 gegangen weit jenseits der Beugungsgrenze, noch nie dagewesene Detail in die Struktur und Funktion von lebenden Zellen zu liefern. Voll zu verstehen, wie diese Systeme Verhalten erfordert jedoch dynamische Informationen sowie Strukturinformationen. Die oben aufgeführten Höchstauflösung Methoden beinhalten einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und zeitlicher Auflösung, Begrenzung der zeitlichen Präzisions mit der dynamische Prozessen sondiert werden können. Eine Methode, die liefert hochpräzise räumliche und zeitliche Auflösung ist RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Wir unterscheiden hier zwischen traditionellen 3D-SPT30 und RT-3D-SPT. Traditional 3D-SPT erfordert lediglich eine Zeitreihe von dreidimensionalen Bilddaten (die entweder mit einem confocal Mikroskop oder einem Epifluoreszenz Mikroskop erworben werden können Angesichts der richtigen Konfiguration). In traditionellen 3D-SPT sind die Koordinaten des Partikels nach der Datenerfassung entschlossen durch Auffinden der Partikel in jedem Bildstapel und die Standorte in aufeinander folgenden Bänden zu verketten, eine Flugbahn zu schaffen. Für diese Methoden ist die ultimative zeitliche Auflösung durch die volumetrische Bildverarbeitung Rate bestimmt. Für konfokale Mikroskope ist dies leicht in der Größenordnung von Sekunden bis zu zehn Sekunden. Für Epifluoreszenz Methoden, wobei der Strahlengang so manipuliert ist, dass die axiale Lage Informationen extrahiert werden kann, ist die zeitliche Auflösung der Kamera Belichtung oder Auslesen zeitlich begrenzt. Diese Epifluorescent-Methoden sind begrenzt im Bereich über dem axiale Informationen gesammelt werden kann, obwohl die jüngsten Fortschritte bei Fourier Flugzeug Phase Masken Design und adaptive Optik weitet diese reicht bis zu 10 µm oder mehr31,32 , 33 , 34.
Im Gegensatz dazu setzt RT-3D-SPT nicht auf einen 3D-Bild Stapel zu erwerben und die Suche nach Partikel nach der Tat. Stattdessen Standort in Echtzeit Informationen über einzelne Punktmelder extrahiert und Feedback werden effektiv "das Teilchen im fokalen Volumen der Objektivlinse durch den Einsatz von piezoelektrischen Bühne Highspeed sperren". Dies ermöglicht kontinuierliche Messung der Position der Partikel begrenzt nur durch wie viele Photonen gesammelt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode spektrale Verhör des Partikels, wie es über große Entfernungen bewegt. RT-3D-SPT Kräfte wirksam funktioniert ähnlich wie eine Kraft-freie optische Falle für nanoskalige Objekte, wobei die Partikel kontinuierlich sondiert und in Echtzeit ohne die Notwendigkeit für große Laserleistungen oder optische gemessen. Angesichts der Tatsache, dass RT-3D-SPT für fortlaufende Befragung schnell diffusiven Objekte (bis zu 20 µm2/s)25,29 in drei Dimensionen bei niedrigen Photon zählen Preise20,29Mittel bietet, 35, es soll ein Fenster in schnell oder vorübergehende biologische Prozesse wie intrazelluläre Frachtverkehr, Ligand-Rezeptor-Bindung und die extrazelluläre Dynamik der einzelnen Virionen. Zu diesem Punkt wurde jedoch die Anwendung der RT-3D-SPT beschränkt sich auf die wenigen Gruppen arbeiten, um diese Technologie zu fördern.
Eine Barriere ist die Komplexität des optischen Layouts erforderlich durch RT-3D-SPT-Methoden, die verschieden sind. Für die meisten Methoden ist die optische Rückmeldung durch einen piezoelektrischen Bühne zur Verfügung gestellt. Wie die Teilchen macht kleine Bewegungen in X, Y oder Z, Anzeigen von Einzelpunkt-Detektoren sind in Fehlerfunktionen konvertiert und gefüttert wiederum drehen bewegt sich auf einem piezoelektrischen Nanopositionierer High-Speed-die Probe, die Partikelbewegung effektiv entgegenzuwirken Sperren sie im Ort bezogen auf das Objektiv. Zur Messung von kleiner positioneller Bewegungen in X, Y und Z, entweder mehrere Detektoren (4 oder 5 je nach Implementierung)15,18,21 oder mehrere Erregung Flecken (2-4, desto geringer die angewendet werden, kann wenn eine Lock-in-Verstärker dient zur extrahieren Sie X und Y-Position mit einer rotierenden laser-spot)25,28 gelten. Die Überlappung dieser mehrere Erkennung und Emission Flecken erschweren die Systeme zu richten und zu pflegen.
Hier präsentieren wir eine High-Speed-Ziel gesperrt 3D-SPT-Methode mit einem vereinfachten optischen Design 3D-DyPLoT29genannt. 3D-DyPLoT verwendet ein 2D-EOD und ein TAG Objektiv36,37,38 , um dynamisch ein fokussierte Laserspot durch das Objektiv Brennweite Volumen mit einer hohen Rate (50 kHz XY, 70 kHz Z) bewegen. Kombination von Laser-Fokus-Position und der Photon-Ankunftszeit ermöglicht 3D Position der Partikel schnell auch bei niedrigen Photon Zählraten eingeholt werden. 2D-EOD treibt Laserfokus eines Ritters Tour Muster39 mit einer quadratischen Größe von 1 x 1 µm in der XY-Ebene und die TAG-Linse bewegt Laserfokus in axialer Richtung mit einer Reichweite von 2-4 µm. Die 3D Partikel-Position wird durch eine optimierte Position Schätzung Algorithmus29,40 in 3D erreicht. Die Kontrolle über das 3D dynamisch bewegten Laser spot, Photon beginnend mit der Lawine Fotodiode (APD), Echtzeit-Partikel Positionsberechnung, piezoelektrische Bühne Feedback und Datenaufzeichnung erfolgt auf einem Feld programmierbare Gate Array (FPGA).In diesem Protokoll haben wir beschrieben, wie Sie Schritt für Schritt, einschließlich der optischen Achse, Kalibrierung mit festen Partikeln, 3D-DyPLoT Mikroskop bauen und endlich frei Particle Tracking. Als eine Demonstration wurden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser für Minuten hintereinander kontinuierlich verfolgt.
Die hier beschriebene Methode ist eine ideale Wahl für alle Anwendungen wo ist es wünschenswert, eine schnell bewegendes fluoreszierende Sonde bei wenig Licht, einschließlich Viren, Nanopartikeln und Vesikel wie Endosomen kontinuierlich zu überwachen. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden gibt es nur eine einzige Anregung und einzelne Erkennung Weg, so dass Ausrichtung und Wartung einfach. Darüber hinaus ermöglicht der großen Erfassungsbereich dieses Mikroskop leicht schnell diffundierende Teilchen, während die Fähigkeit, bei niedrigen Signalpegeln (bis 10 kHz) verfolgen diese Methode ideal für Low-Light Anwendungen29macht abholen.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Echtzeit-dreidimensionale Einzelkorn tracking (RT-3D-SPT) hat das Potenzial, schnell, 3D Prozesse in zellulären Systemen beleuchten. Obwohl verschiedene RT-3D-SPT-Methoden in den letzten Jahren vorgeschlagen haben, bleibt high-Speed-tracking 3D diffundierende Teilchen bei niedrigen Photon Zählraten eine Herausforderung. Darüber hinaus sind RT-3D-SPT-Setups in der Regel komplex und schwierig zu implementieren, Begrenzung ihrer weitverbreitete Anwendung auf biologische Probleme. Dieses Protokoll stellt ein RT-3D-SPT-System namens 3D dynamische Photon Lokalisierung Tracking (3D-DyPLoT), die Partikel mit hoher diffusiven Geschwindigkeit (bis zu 20 µm2/s) verfolgen können bei niedrigen Photon Zählraten (bis 10 kHz). 3D-DyPLoT beschäftigt einen 2D elektrooptischen Deflektor (2D-EOD) und eine einstellbaren akustischen Farbverlauf (TAG) Objektiv zu fahren, die eine einzige konzentrierte sich laser-Spot dynamisch in 3D. In Kombination mit einer optimierten Position Schätzung Algorithmus, kann 3D-DyPLoT auf einzelne Partikel mit hoher Verfolgungsgeschwindigkeit und hohe Lokalisierung Präzision sperren. Aufgrund der einheitlichen Erregung und einzelne Erkennung Pfad Layout ist 3D-DyPLoT robust und einfach einzurichten. Dieses Protokoll beschreibt die 3D-DyPLoT Schritt für Schritt aufbauen. Erstens ist das optische Layout beschrieben. Als nächstes wird das System kalibriert und optimiert durch Raster eine 190 nm fluoreszierende Perle mit piezoelektrischen Nanopositionierer scannen. Schließlich, um Echtzeit-3D tracking-Fähigkeit zu demonstrieren, werden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser verfolgt.

Feste Partikel (Abbildung 4) scannen und frei diffundierende 110 nm fluoreszierende Partikel tracking (Abbildung 5) wurden nach der oben genannten Protokolls durchgeführt. Das Teilchen Scannen erfolgte durch den piezoelektrischen Nanopositionierer und bin Photonen bewegen, während gleichzeitig Berechnung des Partikels Position an jedem Punkt im Scan geschätzt. Der Scan Bild zeigt ein Quadrat von sogar Intensität (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Aufrufe.  Duke University. Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Serie: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Image-based Lagrangian Particle Tracking in Bed-load Experiments

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a relatively low cost. This manuscript describes an application of particle tracking velocimetry (PTV) to a bed-load experiment with lightweight sediment. The key characteristics of the investigated sediment transport conditions were the presence of a covered flow and of a fixed rough bed above which particles were released in limited number at the flume inlet. Under the applied flow conditions, the motion of the individual bed-load particles was intermittent, with alternating movement and stillness terms. The flow pattern was preliminarily characterized by acoustic measurements of vertical profiles of the stream-wise velocity. During process visualization, a large field of view was obtained using two action-cameras placed at different locations along the flume. The experimental protocol is described in terms of channel calibration, experiment realization, image pre-processing, automatic particle tracking, and post-processing of particle track data from the two cameras. The presented proof-of-concept results include probability distributions of the particle hop length and duration. The achievements of this work are compared to those of existing literature to demonstrate the validity of the protocol.

The manuscript presents a protocol for the conduction of bed-load sediment transport experiments where the moving particles are tracked by image analysis. The experimental facility, the procedures for run realization and data processing, and finally some proof-of-concept results are presented here.

Bildbasierte Lagrange-Partikel-Tracking in Bettlasten-Experimenten

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a ...

Forschung

Umwelt

Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

Dreidimensionale Particle Tracking Velocimetry für Turbulence Anwendungen: Fall eines Jet Fluss

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

Ingenieurwesen

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Vorbereitung und 3D-Tracking von Catalytic Schwimmgeräte

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Biochemie

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biotechnik

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neurowissenschaften

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...