Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der feinen Morphologie von Netzhautneuronen und kann Einblicke in die zellulären und subzellulären morphologischen Veränderungen geben, die in Krankheitszuständen auftreten. Diese Methode verbessert die optische Transparenz der Netzhaut erheblich und ermöglicht hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung, Schaltkreisverdrahtung und feine subzelluläre Strukturen von Netzhautneuronen in der Hormonnetzhautvorbereitung. Die Mausaugen mit einer gekrümmten Zette auffüllen und in eine kleine Petrischale mit 0,1 M PBS überführen.
Stechen Sie ein kleines Loch entlang der Hornhautsklera-Verbindung mit der Nadel unter dem Dissektionsmikroskop und übertragen Sie dann das Auge für eine Stunde in 4% Power-Formaldehyd. Übertragen Sie das Auge zurück auf eine Schüssel mit PBS. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine Dissektionsschere, um den gesamten Weg um die Hornhautübergang herum zu schneiden.
Hornhaut und Linse entfernen. Schneiden Sie es dann an der Basis des Sehnervs ab und schälen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Ziffe ab, um die Netzhaut zu isolieren. Machen Sie vier kleine Schnitte gleichmäßig um die Netzhaut und verwenden Sie eine feine Spitzenbürste, die in PBS getaucht ist, um sie mit flacher GCL-Seite in der kleeartigen Form auf einen kleinen quadratischen Schnitt aus Nitrocellulose-Filterpapier zu legen.
Nehmen Sie die Ecke des Nitrocellulosepapiers mit einer Handzette auf und legen Sie sie für eine Stunde in eine 48-Well-Platte mit 4% Power-Formaldehyd, dann das Filterpapier und die Netzhaut in eine Vertiefung mit PBS geben und dreimal für jeweils fünf Minuten waschen. A4P0-Lösung auf Eis auftauen. Anschließend die Netzhaut in die A4P0-Lösung überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanftem Rühren inkubieren.
Fügen Sie Pflanzenöl in den Brunnen hinzu, um die A4P0-Lösung vollständig abzudecken. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 40 Grad Celsius für drei Stunden ohne Schütteln. Dann dreimal in PBS für fünf Minuten pro Waschgang waschen.
Inkubieren Sie die Netzhaut in 10% Natriumdodecylsulfat bei 40 Grad Celsius für zwei Tage mit sanftem Schütteln, dann übertragen Sie das Filterpapier und die Netzhaut mit Triton X-100 auf PBS und waschen Sie fünfmal für 90 Minuten pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche die Netzhaut bei vier Grad Celsius in PBS-T mit 0,01% Natriumazid lagern oder direkt zur Immunfärbung übergehen. Entfernen Sie die Netzhaut vom Filterpapier, indem Sie sie vorsichtig mit einem feinen Spitzenpinsel in PBS-T abziehen.
Inkubiert in primärem Antikörper, verdünnt in Blocklösung für zwei Tage bei 40 Grad Celsius mit sanftem Schütteln. Nach der Inkubation fünfmal für 90 Minuten in PBS-T waschen. Inkubieren Sie die Netzhaut mit geeigneten sekundären Antikörpern, die in Blocklösung verdünnt sind, zwei Tage lang bei 40 Grad Celsius unter sanftem Schütteln.
Schützen Sie die Proben während des restlichen Verfahrens vor Licht. Waschen Sie die Netzhaut fünfmal für 90 Minuten in 0,02 M Phosphatpuffer. Schließlich wird die Netzhaut in Sorbitol-basierter Brechungsindex-Matching-Lösung bei 40 Grad Celsius über Nacht mit sanftem Schütteln inkubiert.
Umreißen Sie einen Glasabdeckungsschlupf mit einem feinen Spitzen-Permanentmarker, um eine quadratische Grenze auf der Rückseite eines Glasmikroskopobjektträgers zu markieren. Drehen Sie den Schieber um und verwenden Sie eine Spritze, um die Grenze mit einer dünnen Linie silikone Fett auf der Vorderseite des Objektträgers zu verfolgen. Lassen Sie einen kleinen Spalt in einer Ecke, damit überschüssige Montagelösung entweichen kann.
Übertragen Sie die Netzhaut in die Mitte des begrenzten Bereichs und positionieren Sie sie mit einem feinen Spitzenpinsel so, dass sie flach mit der Photorezeptorseite gegen den Glasträger liegt. Pipette etwa 60 Mikroliter sRIMS, so dass es die abgeflachte Netzhaut bedeckt und sich bis zu einer Ecke des Gehäuses erstreckt. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut flach und an Ort und Stelle bleibt.
Tragen Sie den Deckelschlupf ab der Ecke mit dem sRIMS auf und senken Sie ihn langsam ab, bis er das Fett auf allen Seiten berührt. Legen Sie einen Stapel von drei Deckelzetteln auf jede Seite der montierten Netzhaut als Abstandhalter. Verwenden Sie die lange Kante eines anderen Schlittens, um den Deckelzettel nach unten zu drücken, so dass die Halterung flach und gleichmäßig ist.
Lagern Sie die Dias bei vier Grad Celsius bis zur Bildgebung. Beginnen Sie, indem Sie den Objektträger auf den Mikroskopstand legen und die Probe lokalisieren. Um Z-gestapelte Bilder von Proben zu erhalten, konzentrieren Sie sich zunächst auf das Signal in jedem Kanal einzeln und stellen Sie die Belichtungszeit bzw. Scangeschwindigkeit für Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope ein.
Legen Sie den Bereich für den Z-Stapel fest, indem Sie entweder die Fokusebene oben und unten im gewünschten Bereich manuell einstellen oder indem Sie den Mittelpunkt einstellen und dann einen Bereich um den Mittelpunkt angeben. Passen Sie die Schrittgröße oder die Anzahl der Slices wie gewünscht an. Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Originaldatei.
Dann als TIF-Datei oder ein anderes gewünschtes Format exportiert. Verwenden Sie die Bildanalyse, eine Software Ihrer Wahl, um die Helligkeit und den Kontrast in jedem Kanal anzupassen, bis sowohl in den Einzelbildern als auch in der dreidimensionalen Wiedergabe des Z-Stacks eine optimale Klarheit erreicht ist. Bei der Verarbeitung mit dem modifizierten CLARITY-Protokoll wurde eine vollständige optische Transparenz über die gesamte Dicke der Netzhaut im Vergleich zu nicht verarbeiteten Kontroll-Netzhäuten beobachtet.
Z-gestapelte Bilder für Arrestin-markierte Kegel in ONL, TH-markierte DACs in INL und RBPMS-markierte RGCs in GCL werden hier gezeigt. Die relative Position von Neuronen über die gesamte Dicke der Netzhaut wurde im Overlay-Bild beobachtet. TH-Färbung und CLARITY verarbeitete ganze Mount Netzhaut wurde mit Bildern aus der Standardvorbereitung verglichen.
Dendriten und axonähnliche Prozesse von DACs wurden in einer klar verarbeiteten Netzhaut deutlicher aufgedeckt als in einer Standard-Netzhaut. Axonartige Prozesse von DACs zeigten im Vergleich zu einer Standard-Netzhaut vollständige ringartige Strukturen in einer klaren Netzhaut. Ringförmige Strukturen der CLARITY-Netzhaut, die mit Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, waren fast identisch mit denen, die mit konfokaler Mikroskopie beobachtet wurden.
Die axonartigen Prozesse liefen auch in Richtung der äußeren Netzhaut. Die Immunfärbung gegen GluA2 und PSD-95 zeigte eine ausgeprägte Punktion, die einzelne GluA2-haltige AMPA-Rezeptoren bzw. mutmaßliche postsynaptische Stellen aufdeckte. Ein Overlay-Bild zeigte einige Punkte bei DAC-Prozessen.
Die Punkte der mutmaßlichen Kollokalisierung wurden in XZ-, YZ- und XY-Ebenen dargestellt und TH-Kolokalisierung sowohl mit GluA2 als auch mit PSD-95 klar co-lokalisiert. Es ist wichtig, dass die Netzhaut während des Hydrogelpolymerisationsprozesses flach bleibt, damit die gereinigte Netzhaut für den Montage- und Bildgebungsprozess flach liegen kann.
