Dieses Protokoll kann speziell kalziumhaltige Nanokristalle im menschlichen Urin nachweisen. Diese Technik könnte möglicherweise nützlich sein, um frühe Stadien der Nierensteinbildung sowie andere Krankheiten im Zusammenhang mit Kristallharnstoff vorherzusagen. Demonstrieren wird das Verfahren von Dr. Parveen Kumar, einem Forscher IV in meinem Labor.
Lassen Sie die Teilnehmer drei Tage lang eine oxalatarme Diät zu sich nehmen und über Nacht fasten. Sammeln Sie dann eine 24-Stunden-Urinprobe von den Teilnehmern, bevor sie eine Oxalatladung konsumieren. Füttern Sie die Teilnehmer mit einem Smoothie mit Obst und Gemüse mit einer Oxalatladung von etwa acht Millimol.
Lassen Sie die Teilnehmer ihren Urin für 24 Stunden nach dem Oxalatkonsum sammeln und am nächsten Tag zurückgeben. Halten Sie alle Urinproben vor der Verarbeitung bei Raumtemperatur. Messen und aufzeichnen Sie den pH-Wert und das Volumen der Urinproben.
Gründlich mischen und 50 Milliliter Urin in ein markiertes steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie es dann und brauen Sie das Pellet erneut mit fünf Millilitern 100% Ethanol auf.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 100% Ethanol. Lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verarbeitung oder fahren Sie sofort mit dem Färben der Proben fort.
Verdünnen Sie 100 nanometergroße Goldnanopartikel in Reinstwasser im Verhältnis 1:1.000 und verwenden Sie sie zur Optimierung der Einstellungen am Instrument. Verdünnen Sie die Urinproben 20 Mal in Wasser, bevor Sie sie mit fünf Millimolar Fluo-4 AM für 30 Minuten im Dunkeln färben und die Proben mit NTA analysieren. Bereiten Sie Calciumoxalat- und Calciumphosphatkristalle vor, wie im Textmanuskript beschrieben, bevor Sie die NTA-Analyse durchführen.
Schalten Sie den Computer und das Instrument ein, öffnen Sie dann die Software und schalten Sie die Kamera ein. Klicken Sie auf das Aufnahmesymbol in der oberen linken Ecke des Fensters, um den Aufnahmemodus zu starten. Reinigen Sie die Plattform, indem Sie zuerst Luft mit einer Ein-Milliliter-Spritze in sie pumpen, bis die Plattform sauber erscheint.
Geben Sie dem Gerät zwei- bis dreimal vorsichtig Wasser hinzu und verwenden Sie eine weitere Milliliterspritze, um Luftblasen zu entfernen. Sobald die Plattform sauber ist, fügen Sie Wasser hinzu und überprüfen Sie die Kamera auf Verunreinigungen auf der Oberfläche, und fügen Sie dann Goldnanopartikel als Kontrolle zum Probenladepumpeninjektor hinzu, um das Instrument einzurichten. Passen Sie die Kameraebene auf dem Bildschirm oder am Knopf auf der rechten Seite des Instruments an, bis das Bild beginnt, farbige Pixel anzuzeigen, und reduzieren Sie dann die Kameraebene.
Als nächstes passen Sie den Bildschirm an, um das Bild zu optimieren. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Videobild. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt und ziehen Sie das Bild nach oben und unten, um die gesamte Ansicht zu erhalten.
Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit ein und fokussieren Sie die Kamera so, dass die Goldnanopartikel auf dem Kamerabildschirm sichtbar sind. Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit für die Ersteinrichtung auf hoch ein, um sicherzustellen, dass die Goldnanopartikel erkannt werden. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit nach dem Nachweis auf 50 Mikroliter pro Minute, um Goldnanopartikel zu visualisieren.
Passen Sie die Kameraebene an, um die Partikel zu visualisieren. Für nicht gefärbte Proben passen Sie die Bildschirmverstärkung auf Stufe fünf an, um den Kamerafokus zu erreichen, und stellen Sie die Kameraebene auf acht ein. Sobald der Fokus eingestellt ist, zeichnen Sie die Probe auf.
Reinigen Sie das Gerät nach der Optimierung erneut mit Wasser, bevor Sie andere Proben bewerten, um sicherzustellen, dass der Schlauch sauber ist und keine Partikel vorhanden sind. Um gefärbte Proben zu analysieren, stellen Sie die Kamera auf die Filterposition ein, die den geeigneten Fluoreszenzfilter enthält, und laden Sie verdünnte und gefärbte Proben auf den Probenladepumpeninjektor, wodurch die Geschwindigkeit für die Analyse auf 20 Mikroliter pro Minute reduziert wird. Stellen Sie die Bildschirmverstärkung auf fünf und die Kamerastufe auf 13 ein.
Speichern Sie die Daten nach jeder Messung. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Nanopartikeln für alle fünf Messwerte für jede einzelne Probe und analysieren Sie die Daten anhand der Standardabweichung oder des Standardfehlers des Mittelwerts. Verwenden Sie T-Tests für die gepaarte Analyse.
Fluo-4 AM konnte sowohl an Calciumoxalatkristalle binden, die zwischen 50 und 270 Nanometer groß waren und eine mittlere Konzentration von 1.260 Millionen Partikeln pro Milliliter aufwiesen, als auch an Calciumphosphatkristalle, die zwischen 30 und 225 Nanometern lagen und eine mittlere Konzentration von 2.220 Millionen Partikeln pro Milliliter aufwiesen. 24-Stunden-Urinproben, die vor der Oxalatbelastung gesammelt wurden, enthielten einige Nanokristalle im Urin zwischen 110 und 300 Nanometern Größe. Im Gegensatz dazu gab es einen signifikanten Anstieg der Nanokristalle im Urin in Postoxalatproben.
Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu bestätigen, wurden die Proben dreimal gemessen und es gab keine signifikanten Unterschiede bei den technischen Replikaten. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, kann es zu Schwierigkeiten beim Hinzufügen von Proben ohne Blasen zur Maschine geben. Um dies zu verhindern, fügen Sie der Maschine Luft und Wasser hinzu und fügen Sie dann langsam Proben hinzu.
Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie Ihre Proben kontinuierlich überwachen und dass keine Blasen vorhanden sind. Diese neue Methode wird an Personen mit Calciumoxalat-Nierensteinerkrankung getestet, um das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen und / oder das Nierensteinrisiko vorherzusagen.
