Esta técnica utiliza instrumentos comumente encontrados na maioria dos ambientes laboratoriais e permite a análise de várias amostras simultaneamente. Este método pode fornecer insights-chave sobre como enzimas de metabolismo lipídico são reguladas em um contexto celular e em diferentes origens genéticas. Inocular uma colônia de uma placa de cultura de levedura em 20 mililitros de mídia SC contendo 2% de dextrose e incubar a 30 graus Celsius durante a noite com agitação a 200 rpm.
No dia seguinte, diluir a cultura em 50 mililitros de mídia fresca para um OD final de 0,2 e cultivá-la por 24 horas até que a fase estacionária seja atingida. Prepare duas alíquotas de 20 mililitros de tampão para cada amostra e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Simultaneamente, prepare a mídia de rotulagem de radiolateração adicionando sal de sódio ácido acético à mídia SC livre dextrose em uma concentração final de 10 microcurie por mililitro.
Recolher as células por centrifugação a 4,100 x g por 10 minutos. Remova o supernatante e lave a pelota celular uma vez com 20 mililitros de mídia SC livre de dextrose. Colete as células novamente por centrifugação a 4,100 x g por cinco minutos e transfira-as para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros rotulados usando mídia livre dextrous.
Centrifugar as células por mais dois minutos. Resuspenja as células em 500 microliters de mídia SC livre de dextrose e inicie o período de radiolabeling adicionando rapidamente 500 microliters de mídia de radiolabeling a cada suspensão celular. Incubar os tubos em uma incubadora rotativa a 30 graus Celsius por 20 minutos.
Enquanto isso, pré esfrie a centrífuga equipada para tubos cônicos de 50 mililitros a menos 10 graus Celsius e descongele uma alíquota de 20 mililitros de tampão de saciamento. Uma vez que o período de rotulagem de rádio tenha terminado use uma pipeta para mergulhar toda a amostra de um mililitro em tampão descongelado no gelo. Colete a pelota de célula girando em uma centrífuga pré-resfriada a 5.000 x g por três minutos e adicione 20 mililitros de tampão frio fresco.
Vórtice e agitar as amostras para resususpensá-las em saciar tampão e centrifugar as amostras novamente para coletar as células. Uma vez que as células sejam pelotas, remova completamente todo o tampão saciado das amostras derramando o sobrenatário e removendo o excesso com uma pipeta. Armazene os tubos a menos 80 graus Celsius para posterior processamento.
Pesar 0,3 gramas de contas de vidro lavadas com ácido para cada amostra e armazená-las em dois tubos de microcentrífugo mililitro no gelo. Remova as pelotas de células do congelador de menos 80 graus e coloque-as no gelo. Em seguida, adicione 350 microliters de metanol e 700 microliters de clorofórmio a cada amostra e resuspenja as células.
Transfira-os para tubos de micro centrífugas contendo contas de vidro pré-pesadas. Lyse as células vórtices três vezes por um minuto, com 30 segundos de incubação no gelo entre agitações. Despeje as células em um tubo de centrífuga de vidro de 15 mililitros e rotule o tubo como tubo A.Lave o tubo de microcentrífuga com um mililitro de metanol, vórtice, e despeje o metanol no tubo A.Adicione dois mililitros de clorofórmio seguidos por 400 microliters de água para tubo A para um volume final de amostra de 4,45 mililitros.
Vórtice as amostras por um minuto seguido de uma centrifugação de cinco minutos a 1000 x g para separar claramente as fases aquosas e orgânicas com detritos celulares deitados na interface. Usando uma pipeta de pastagem de vidro, colete a fase orgânica em um novo tubo de centrífuga de vidro rotulado B e adicione um mililitro de um cloreto de potássio molar. Adicione um mililitro de metanol e dois mililitros de clorofórmio ao tubo A e repita os passos de vórtice e centrífugação.
Vórtice e tubo de centrífuga B para separar a fase aquosa e orgânica. Remova a camada aquosa superior e colete toda a camada orgânica inferior em um frasco de vidro de quatro mililitros. Evaporar completamente o solvente dos extratos lipíduos secando sob gás inerte e pré-aquecer um forno a 145 graus Celsius para aquecer a placa TLC.
Determine quantidades relativas de radiolabel tomadas pelas células antes de carregá-las na placa TLC. Reconstitua os lipídios amostrais em 40 a 50 microlitres de clorofórmio e metanol misturados a uma proporção de um para um por vórtice por cinco minutos. Prepare 101 mililitros do solvente de fase móvel em um cilindro graduado em vidro.
Em seguida, despeje o solvente em uma câmara TLC de vidro contendo uma almofada de saturação de 20 por 20 TLC e uma tampa apertada de encaixe. Prepare uma placa canalizada de 20 por 20 gel de sílica 60G e marque uma linha 1,5 centímetros acima da parte inferior da placa usando um lápis. Uma vez que a placa tenha sido suficientemente aquecida e a almofada de saturação TLC esteja saturada com solvente, remova a placa TLC do forno e continue imediatamente a carregá-la.
Usando uma pipeta, localize cinco microliters de amostra sobre a origem de cada pista localizada 1,5 centímetros acima da parte inferior da placa TLC e repita o carregamento até que 20 a 40 microliters de amostra tenha sido carregado em cada pista. Uma vez que o padrão e as amostras tenham sido carregadas, coloque a placa na câmara em desenvolvimento e espere até que o solvente chegue ao topo da placa. Quando a placa estiver totalmente desenvolvida, remova-a da câmara e deixe-a secar no capô da fumaça por 20 minutos.
Depois que a placa estiver seca, cubra-a com filme plástico e coloque-a em um em desenvolvimento com uma tela autordiografia. Remova a tela do em desenvolvimento e coloque-a dentro de um imager de fósforo. Pulverize a placa TLC com reagente p-Anisaldeído até que a sílica esteja saturada, depois asse em forno de 145 graus por cinco minutos ou até que as bandas tenham aparecido.
Para quantificar espécies lipídicas, raspe o gel de sílica contendo espécies lipídicas individuais e transfira-as para frascos de cintilação de vidro. Adicione seis mililitros de fluido de cintilação e vórtice vigorosamente até que a banda de sílica tenha sido reduzida a pequenos pedaços. Coloque o rack com os frascos de cintilação em um contador de cintilação e conte ajustando o tempo de contagem para dois minutos por frasco.
A imagem do fósforo permite a visualização de autordiograma de ácido graxo sem rótulo, triacylglicerol, diacylglycerol, colesterol e esqualano. Foi demonstrado que espécies lipídicas purificadas podem ser separadas neste método e posteriormente visualizadas pela pulverização da placa TLC com reagente p-Anisaldeído. Espécies visualizadas incluem todos os lipídios mencionados anteriormente, além de ésteres estéreis.
Aplicando um período de perseguição de 10 minutos na mídia sem rótulo de rádio após o pulso, foi observado na maior piscina de esqualano desaparecido e o colesterol total foi elevado. Da mesma forma, o aparecimento de diacilglicerol no período de perseguição correlaciona-se com uma diminuição no sinal de ácidos graxos livres. Antes de realizar o protocolo completo, é importante determinar se as células irão captar o radiolabel ácido acético na condição de crescimento e no histórico genético de interesse.
