Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die AKTIVITÄT der RNA-Polymerase II widerspiegelt, indem sie neu synthetisierte mRNA misst, die nicht durch den RNA-Abbau beeinflusst werden. Dieses Protokoll wurde ursprünglich mit Hilfe der Mikroarray-Hybridisierung beschrieben, kann aber leicht zur hochdurchdachten Sequenzierung von neu transkribierter mRNA übernommen werden. Demonstriert wird dieses Verfahren von Tiago Baptista, einem ehemaligen Grad-Studenten aus unserem Labor.
Nach der Impfung der S.cerevisiae Zellen, wachsen sie über Nacht bei 30 Grad Celsius mit konstanter Agitation bei 150 U/min. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte bei 600 Nanometern. Verdünnen Sie die Kultur auf eine OD600 von etwa 0,1 in 100 Milliliter YPD Medium.
Wachsen Sie die Zellen, bis die OD600 ist etwa 0,8. Danach messen Sie die OD600 der S.pombe Übernachtungskultur. Verdünnen Sie diese Kultur auf eine OD600 von etwa 0,1 in 500 Milliliter YAS-Medium und lassen Sie es wachsen, bis die OD600 etwa 0,8 ist.
Zuerst bereiten Sie eine frische Lösung von zwei molaren Vierthiouracil. Halten Sie die vorbereitete Lösung bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Fügen Sie die Vier-Thiouracil-Lösung zu den S.cerevisiae und S.pombe Kulturen, so dass die endgültige Konzentration beträgt fünf Millimolar.
Die S.cerevisiae und S.pombe Kulturen bei 30 Grad Celsius bzw. 32 Grad Celsius mit ständiger Agitation für sechs Minuten inkubieren. Danach entfernen Sie ein kleines Aliquot jeder Kultur und zählen Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einer Neubauer-Kammer. Zentrifuge bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu sammeln.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit eiskalt ein mal PBS. Zentrifuge wieder bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes, setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter eiskalt ein Mal PBS.
Mischen Sie die S.cerevisiae und S.pombe Zellen in einem Verhältnis von drei zu eins. Zentrifugieren Sie die gemischten Proben bei 2, 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann entfernen Sie die PBS und blitzen die Zellen in flüssigem Stickstoff einfrieren.
Bewahren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Zellen auf Demeis für etwa 20 bis 30 Minuten auf. Verwenden Sie ein angepasstes Hefe-RNA-Extraktionskit, um die RNA zu extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben.
Danach die Filterpatrone in das endgnohe Entnahmerohr übertragen. Elute die RNA mit 50 Mikroliter DEPC-behandeltem RNase-freiem Wasser, das auf 100 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute.
Verwenden Sie dann 50 Mikroliter vorgewärmtes, mit DEM DEPC behandeltes RNase-freies Wasser, um die RNA wieder in dieselbe Röhre zu bringen. Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenvolumen durch den Filter gegangen ist. Ist dies nicht der Fall, zentrifugieren Sie wieder für einen längeren Zeitraum.
Nach Fertigstellung die Reinheit der Probe mit der entsprechenden Ausrüstung zu quantifizieren und zu überprüfen. Verwenden Sie DEPC-behandeltes nukleasefreies Wasser, um die Konzentration der zuvor erworbenen RNA auf zwei Milligramm pro Milliliter einzustellen. Aliquot 200 Mikrogramm gesamter RNA und erhitzen sie bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten.
Sofort zwei Minuten auf Eis abkühlen lassen. Fügen Sie 600 Mikroliter DEPC-behandeltes RNase-freies Wasser hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter Biotinylierungspuffer hinzu und fügen Sie dann 200 Mikroliter Biotin HPDP hinzu.
Wenn die Biotin HPDP-Lösung aus der Lösung herausfällt, erhöhen Sie das Volumen von DMSO oder DMF um bis zu 40 % des Reaktionsvolumens, wie im Textprotokoll beschrieben. Schützen Sie die Probe vor Licht und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung für drei Stunden. Danach ein ungefähr gleiches Chloroformvolumen in die Rohre geben und kräftig mischen.
Zentrifuge bei 13.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes übertragen Sie die obere Phase vorsichtig in neue Zwei-Milliliter-Röhren. Fügen Sie eine Menge von fünf molarem Natriumchlorid in Höhe von etwa 1/10 des Probenvolumens hinzu.
Mischen Sie dann die Probe. Zuerst erhitzen Sie die biotinylierte RNA bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann kühlen Sie die Proben auf Eis für fünf Minuten.
Fügen Sie der biotinylierten RNA 100 Mikroliter Streptavidin-beschichteter Magnetperlen hinzu. Bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln 90 Minuten bebrüten. Legen Sie die mit dem Kit gelieferten Säulen in den magnetischen Ständer.
Als Nächstes fügen Sie 900 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer zu den Säulen hinzu. Tragen Sie die 200 Mikroliter Perle und RNA-Mischung auf die Spalten auf. Sammeln Sie den Durchfluss in 1,5 Milliliter-Röhren und wenden Sie ihn dann erneut auf dieselbe Magnetsäule an.
Halten Sie diesen Durchfluss bei Bedarf, da er die unbeschriftete RNA-Fraktion darstellt. Um mit der RT-qPCR-Validierung der verschiedenen Fraktionen zu beginnen, synthetisieren Sie zunächst cDNA, wie im Text beschrieben. Verstärken Sie dann die cDNA durch Echtzeit-qPCR mit einem Standardprotokoll.
Die gemessenen Transkripte in Fraktionen, die von Wildzellen gereinigt wurden, die mit und ohne Vierthiouracil kultiviert wurden, bestätigten dieses Verfahren, das speziell markierte RNA reinigt. Die Analyse des spt20 Deltastamms zeigt, dass die Menge der gesamten stationären RNA weitgehend unverändert ist oder für die getesteten Gene nur leicht reduziert wird. Ähnliche Ergebnisse werden für Stämme gesehen, die für bre1 gelöscht wurden.
Die Analyse der neu transkribierten RNA im spt20-Delta-Stamm zeigt jedoch eine drei- bis fünffache Abnahme der mRNA-Synthese für alle getesteten Gene. In der Zwischenzeit führt der Verlust von bre1 zu einem diskreteren, aber immer noch sichtbaren Rückgang. Bei unzerstörbarer Erschöpfung von spt7 wird eine strukturelle Untereinheit des Saga-Komplexes, neu transkribierte mRNA-Spiegel, in einem Ausmaß reduziert, das dem Löschstamm ähnelt.
Wenn die gesamten RNA-Spiegel durch genomweite Analyse gemessen werden, werden nur wenige Gene gesehen, dass ihre Expressionsniveaus beim Löschen von spt20 entweder durch Regulierung oder Down-Regulierung verändert werden. Die Analyse der neu transkribierten RNA zeigt jedoch, dass die Konzentrationen von über 4.000 Genen bei der Deletion von spt20 signifikant um das Zweifache reduziert werden, was auf eine globale positive Wirkung der Saga auf die Transkription der RNA-Polymerase II bei angehenden Hefen hindeutet. Obwohl diese Methode Einblicke in die Transkription in Saccharomyces cerevisiae liefern kann, wurde sie nur mit leichten Variationen angewendet, durch die Verwendung dieses Protokolls konnten wir eine globale Abnahme der mRNA-Synthese feststellen, die durch eine globale Abnahme des mRNA-Abbaus kompensiert wurde.
