이 기술은 대부분의 실험실 환경에서 일반적으로 발견되는 계측을 사용하며 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다. 이 방법은 지질 대사 효소가 세포 문맥과 다른 유전 적 배경에서 어떻게 조절되는지에 대한 주요 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 효모 배양판에서 식민지를 200rpm에서 흔들며 하룻밤 동안 섭씨 30도에 2%의 덱스트로스를 함유한 SC 미디어의 20밀리리터로 접종합니다.
다음 날, 신선한 매체의 50 밀리리터에서 문화를 최종 OD0.2로 희석하고 고정 단계에 도달할 때까지 24 시간 동안 성장합니다. 각 샘플에 대해 담금질 버퍼의 두 밀리리터 알리쿼트두를 준비하고 영하 80도에서 저장합니다. 동시에, 백리터 당 10 마이크로큐리의 최종 농도에서 덱스트로스 무료 SC 미디어에 아세트산 나트륨 염을 추가하여 방사성 라벨링 미디어를 준비한다.
10 분 동안 4, 100 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 상체를 제거하고 덱스트로스 무료 SC 미디어의 20 밀리리터로 한 번 셀 펠릿을 세척하십시오. 5 분 동안 4, 100 x g에서 원심 분리하여 세포를 다시 수집하고 덱스트로우스 프리 미디어를 사용하여 라벨이 붙은 2 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다.
세포를 또 다른 2분 동안 원심분리합니다. 덱스트로스 무료 SC 미디어의 500 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 각 세포 현탁액에 500 마이크로리터의 방사성 라벨링 미디어를 신속하게 추가하여 방사성 라벨링 기간을 시작합니다. 회전하는 인큐베이터에서 20분 동안 30도의 배양합니다.
한편, 50 밀리리터 원뿔관을 장착한 원심분리기를 영하 10도까지 미리 식히고 담금질 버퍼의 20밀리리터 알리쿼트 하나를 해동하십시오. 무선 라벨링 기간이 끝나면 파이펫을 사용하여 1밀리리터 샘플 전체를 얼음 위에 해동된 담금질 버퍼로 떨어집니다. 3 분 동안 5, 000 x g에서 미리 냉각 된 원심 분리기에서 회전하여 셀 펠릿을 수집하고 신선한 차가운 담금질 버퍼 20 밀리리터를 추가하십시오.
소용돌이와 완전히 담금질 버퍼에서 그들을 다시 중단하고 세포를 수집하기 위해 샘플을 원심 분리하기 위해 샘플을 흔들어. 세포가 펠릿화되면, 상류체를 부어 파이펫으로 과잉을 제거하여 샘플에서 모든 담금질 버퍼를 철저히 제거합니다. 튜브를 영하 80도에 저장하여 추가 처리를 위해 튜브를 보관하십시오.
각 샘플에 대해 0.3 그램의 산 세척 유리 구슬을 무게와 얼음에 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 저장합니다. 영하 80도 냉동고에서 셀 펠릿을 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 각 샘플에 메탄올 350 마이크로리터와 700 마이크로리터의 클로로폼을 추가하고 세포를 다시 중단합니다.
미리 계량된 유리 구슬이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기십시오. 1 분 동안 세 번 소용돌이에 의해 세포를 lyse, 와 함께 30 동요 사이의 얼음에 잠복. 세포를 15밀리리터 유리 원심분리기 튜브에 붓고 튜브 A.Wash 와 마이크로센트심분리기 튜브를 메탄올 1밀리리터로 세척하고, 소용돌이를 피하고, 메탄올을 튜브 A.에 2밀리리터를 넣고 4.45밀리리터의 최종 샘플 볼륨을 위해 튜브 A에 400 마이크로리터를 넣습니다.
1분 동안 시료를 1000 x g로 5분간 원심분리하여 계면에 세포 파편이 있는 수성 및 유기상을 명확하게 분리합니다. 유리 목초지 파이펫을 사용하여, B 라벨새로운 유리 원심 분리튜브에 유기 상을 수집하고 하나의 어금니 칼륨 염화 칼륨의 1 밀리리터를 추가합니다. 메탄올 1밀리리터와 클로로폼 2밀리리터를 튜브 A에 넣고 소용돌이 및 원심분리 단계를 반복합니다.
소용돌이 및 원심분리기 튜브 B는 수성 및 유기상을 분리합니다. 상부 수성 층을 제거하고 전체 하단 유기 층을 4 밀리리터 유리 바이알로 수집합니다. 불활성 가스 하에서 건조하여 지질 추출물에서 용매를 완전히 증발시키고 오븐을 섭씨 145도로 예열하여 TLC 플레이트를 가열합니다.
TLC 플레이트에 적재하기 전에 세포에서 채택한 상대적인 양의 방사성 라벨을 결정합니다. 5분 동안 소용돌이를 통해 1대1 비율로 혼합된 클로로폼과 메탄올의 40~50마이크로리터에서 시료 지질을 재구성한다. 유리 졸업 실린더에서 이동상 용매의 101 밀리리터를 준비합니다.
그런 다음 20 tLC 포화 패드와 타이트 핏 뚜껑을 포함하는 유리 TLC 챔버에 용매를 붓습니다. 20 x 20 실리카 젤 60G 플레이트를 계측하고 연필을 사용하여 플레이트 바닥 의 1.5센티미터 를 표시합니다. 플레이트가 충분히 가열되고 TLC 포화 패드가 용매로 포화되면 오븐에서 TLC 플레이트를 제거하고 즉시 적재합니다.
파이펫을 사용하여 TLC 플레이트 의 바닥 1.5센티미터에 위치한 각 차선의 원점까지 5마이크로리터의 시료를 발견하고 20~40마이크로리터의 시료가 각 차선에 적재될 때까지 로딩을 반복합니다. 표준과 샘플이 로드되면 플레이트를 개발 챔버에 놓고 용매가 플레이트 의 상단에 도달 할 때까지 기다립니다. 플레이트가 완전히 개발되면 챔버에서 꺼내 연기 후드에서 20 분 동안 건조시키십시오.
접시가 말린 후 플라스틱 필름으로 덮고 사인 라디오 그래피 스크린이있는 개발 카세트에 놓습니다. 개발 중인 카세트에서 화면을 제거하고 인광선 이미지기 내부에 놓습니다. 실리카가 포화 될 때까지 P-아니살데히드 시약으로 TLC 플레이트를 분무한 다음 5 분 동안 또는 밴드가 등장 할 때까지 145도 오븐에서 구워줍니다.
지질 종을 정량화하려면 개별 지질 종을 포함하는 실리카 젤을 긁어 유리 반짝이 바이알로 옮습니다. 실리카 밴드가 작은 조각으로 감소 될 때까지 6 밀리리터의 신경유체와 소용돌이를 적극적으로 추가합니다. 신경병 바이알이 있는 랙을 신경화 카운터에 넣고 바이알당 계산 시간을 2분으로 조정하여 계산합니다.
인광 화상 진찰은 라벨이 없는 지방산, 트리아실글리세롤, 디아실리세롤, 콜레스테롤 및 스쿼레인의 자동 방사선 사진의 시각화를 허용합니다. 정제된 지질종은 이 방법으로 분리될 수 있으며, 이어서 P-아니살데히드 시약으로 TLC 플레이트의 분무에 의해 시각화될 수 있음을 입증하였다. 시각화 된 종은 멸균 에스테르 이외에 이전에 언급 된 모든 지질을 포함한다.
맥박 에 이어 라디오라벨이 없는 매체에 10분 추격 기간을 적용함으로써, 스쿼레인의 주요 풀에서 관찰되었고 총 콜레스테롤이 상승되었다. 유사하게, 추격 기간에 투석기의 출현은 자유 지방산 신호의 감소와 상관관계가 있다. 전체 프로토콜을 수행하기 전에 세포가 성장 상태 및 관심의 유전 적 배경에서 아세트산 방사성 라벨을 섭취 할 지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.
