Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung von INK-T-Zellen, die sehr selten sind, und ermöglicht eine 30-fache Ausdehnung ihrer Anzahl. Die Reinigung kann an einem Tag durchgeführt werden und produziert in zwei Wochen eine große Anzahl von gebrauchsfertigen INK-T-Zellen für In-vivo- und In-vitro-Studien. Das Verfahren wird Gloria Delfanti, eine Postdoktorandin im Labor, demonstrieren.
Nachdem Sie die Milz der Maus seziert haben, zerschlagen Sie sie durch ein 70-Nanometer-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension in 10 Milliliter PBS mit 2% FBS zu erhalten. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter sterilem Ammoniumchlorid-Kaliumlysinpuffer.
Inkubieren Sie die Zellen für drei Minuten bei Raumtemperatur und blockieren Sie sie dann mit fünf Millilitern PBS mit 2% FBS. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes das Zellpellet in drei Milliliter PBS mit 2% FBS resuspendieren und Fettrückstände durch Pipettieren entfernen.
Halten Sie die Zellen für die Anreicherungsschritte kalt und verwenden Sie Lösungen, die bei vier Grad Celsius vorgekühlt und dann auf Eis gehalten werden. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Alle Zellen in der entsprechenden Menge PBS mit 2% FPS und Fc-Blocker resuspendieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Mit ein bis zwei Millilitern MACS-Trennpuffer pro 10 Millionen Zellen waschen und bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstandes färben Sie die Zellen mit CD19-FITC und H2-IAb-FITC und inkubieren Sie 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius. Waschen Sie Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 Mikroliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen. Fügen Sie 10 Mikroliter Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und 10 Minuten lang bei 300 mal G zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie bis zu 125 Millionen Zellen in 500 Mikroliter MACS-Puffer. Platzieren Sie eine LD-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators.
Um Verstopfungen zu vermeiden, tragen Sie einen Vorzerlegungsfilter auf die LD-Säule auf und spülen Sie sie mit zwei Millilitern MACS-Puffer ab. Tragen Sie die Zellsuspension auf den Filter auf und sammeln Sie die unbeschrifteten Zellen, die die Spalte passieren. Waschen Sie den leeren Säulenbehälter dreimal mit einem Milliliter MACS-Puffer.
Sammeln Sie das mit T-Zellen angereicherte Abwasser und zählen Sie die Zellen, wobei Sie 50 Mikroliter für die FACS-Analyse aufbewahren. Nach dem Zentrifugieren bei 300 mal G für fünf Minuten den Überstand entfernen und die Zellen mit CD1d Tetramer-PE färben. Gut mischen und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen. Nach der Zentrifugation bei 300 mal G für 10 Minuten den Überstand entfernen und das Zellpellet in 80 Mikroliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen resuspendieren. Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-PE-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu.
Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie bis zu 100 Millionen Zellen in 500 Mikroliter MACS-Puffer.
Platzieren Sie je nach Zellzahl die LS- oder MS-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators und spülen Sie die Säule mit MACS-Puffer ab. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, sammeln Sie unbeschriftete Zellen, die passieren, und waschen Sie die Spalte dreimal wie zuvor beschrieben. Dies ist der negative Bruch.
Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie auf ein neues Auffangrohr. Den MACS-Puffer auf die Säule pipettieren und den mitgelieferten Kolben in die Säule drücken, um die mit INK-T-Zellen angereicherte positive Fraktion auszuspülen. Um die Ink-T-Zell-Wiederherstellung weiter zu erhöhen, zentrifugieren Sie die negative Fraktion bei 300 mal G für 10 Minuten und wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit einer neuen LS- oder MS-Säule.
Ziehen Sie die positiven Fraktionen und bestimmen Sie die Zellzahl. Bewahren Sie 50 Mikroliter positiver und negativer Fraktionen für die FACS-Analyse auf, um die Reinheit zu überprüfen. Um INK-T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins zu aktivieren, übertragen Sie das entsprechende Volumen an Anti-CD3- und CD28-Magnetperlen in eine Röhre und mit einem gleichen Volumen pbS, dann wirbeln Sie für fünf Sekunden.
Legen Sie das Rohr für eine Minute auf einen Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und befestigen Sie die gewaschenen Magnetperlen im richtigen Volumen von RPMI. Zentrifugieren Sie gereinigte INK-T-Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten und mischen Sie sie mit Maus-T-Aktivator Anti-CD3 oder CD28 Magnetperlen.
Einen Milliliter der Zellsuspension, Anti-CD23- und CD28-Magnetperlen in einer 48-Well-Platte mit 20 Einheiten pro Milliliter IL-2 plattieren, dann bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Tagen 10 Nanogramm pro Milliliter IL-7 hinzufügen. Teilen Sie die Zellen in zwei Hälften, wenn sie 80 bis 90% Konfluenz erreichen, und fügen Sie immer 20 Einheiten pro Milliliter IL-2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL-7 hinzu.
Unter diesen Bedingungen können INK-T-Zellen bis zu 15 Tage lang expandiert werden. Mit diesem Protokoll werden INK-T-Zellen durch einen immunmagnetischen Trennprozess aus der Milz transgener Mäuse angereichert. Nach der Anreicherung können die Zellen mit Anti-CD3- und CD28-Kügelchen erweitert werden, was zu einer 30-fachen Ausdehnung im Durchschnitt bis zum 14. Tag der Kultur führt.
Die starke Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD-Kügelchen induzierte die Herunterregulierung der IMK-T-Zell-TCR-Expression auf der Zelloberfläche und eine doppelt negative Population trat auf. Die Mehrheit der expandierten INK-T-Zellen ist CD4-negativ. Die Charakterisierung der linienspezifischen Transkriptionsfaktoren PLZF und ROR gamma T ermöglichte es, die Phänotypen NKT1, NKT2 und NKT17 auf angereicherten INK-T-Zellen am Tag Null und 14 zu identifizieren.
Die angereicherten INK-T-Zellen zeigen einen T80-ähnlichen Effektor-Phänotyp, der nach 14 Tagen der Expansion konserviert wird, wie durch die Sekretion von Interferon gamma und IL-4 nach PMA- und Ionomycin-Stimulation bestätigt wird. Denken Sie während der Reinigungsschritte daran, schnell mit vorgekühlten Lösungen zu arbeiten und Fettrückstände zu entfernen, die beim Pipettieren auftreten können. Erweiterte INK-T-Zellen können für In-vitro-Assays und In-vivo-Transfers in Mäuse genutzt werden, auch nach funktionellen Modifikationen durch Gentransfer oder Editing.
Die In-vitro-Expansion von INK-T-Zellen überwindet die durch den Mangel gegebene Einschränkung und macht sie in präklinischen Studien in den Bereichen Tumorimmunüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunität nutzbar.
