Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der Reynolds Labor an Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft, und das Chen Dong Labor an der University of Texas MD Anderson Cancer Center für die Optimierung dieses Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu JMR von der National Institutes of Health (K22AI104941) unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren werden durchgeführt unter Verwendung von Protokollen vom Büro des Environmental Health and Safety an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft genehmigt. C57BL / 6-Mäuse (von NCI gekauft) für dieses Protokoll wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht sind, und alle Tierversuche wurden unter Verwendung von Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigten an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft. 1. Vorbereitung der Instrumente, Zubehör und Reagenzien <ol><li> Mantel mit 48 Vertiefungen oder 24-Well-Platten mit anti-CD3 und anti-CD28 (Tabelle 1) in sterilem PBS, abdecken und wickeln Sie sie in Parafilm, um Verdunstung und Kontamination zu vermeiden, und dann inkubiert O / N bei 4 o C Vortag T Zellisolierung. Alternativ Mantel Brunnen 1 h bei 37 ° C. Führen Th0, Th1, Th2 und iTreg Bedingungen durch die Beschichtung sowohl anti-CD3 und anti-CD28 bei 1 ug / ml in 0,5 bis 1 ml bistal Volumen (48-Well-Platte). Für Th17 wir typischerweise Mantel anti-CD3 bei 2 ug / ml und Anti-CD28, auf 1 ug / ml. HINWEIS: Wir haben festgestellt, daß eine niedrigere Anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th1, Th2 und iTreg Generation während eine höhere anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th17 Generation. So sollte anti-CD3 und anti-CD28-Konzentrationen titriert und für einzelne Laboratorien (Tabelle 2) optimiert werden. </li><li> Sterilisieren Sie eine Reihe von Dissektionswerkzeuge (Schere und Pinzette) von Autoklaven oder Desinfektionslösung. Ein Rohr oder kleinen Becherglas mit 70% Ethanol wird für die schnelle Sterilisation von Instrumenten zwischen Dissektionen benötigt. Schließlich wird eine Sprayflasche, die 70% Ethanol zum Sterilisieren der Oberfläche der Maus vor Dissektion erforderlich. </li><li> Bereiten Sie eine Dissektion Oberfläche, indem ein flaches Stück Styropor oder Pinnwand mit Aluminiumfolie. Zergliedern Stifte oder Nadeln verwendet werden, um das Tier zu fixieren. </li><li> Bereiten die Gerichte oder Platten für die Sammlung von tiHEMEN. Wenn die Bündelung Geweben, separate 60mm Gerichte 3 ml mit steriler PBS + 1% FBS (PBS +) für Milz und Lymphknotengewebe ausreichend ist. Wenn halten Gewebe von einzelnen Mäusen zu trennen, bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 1 ml PBS + in die gewünschte Anzahl von Brunnen. </li><li> Bereiten vollständigen RPMI-Medium für die Zellkultur und Vorwärmen vor der Anwendung (Tabelle 1). HINWEIS: Es wird routinemäßig RPMI aber auch andere Medien wie IMDM und DMEM ebenso effektiv oder überlegen je Labor und Experiment. </li><li> Cut 2x2 cm große Quadrate von Nylon Netz mit einem 120 &amp; mgr; m Porengröße und Autoklaven zu sterilisieren (Tabelle 1). </li><li> Optional: Wenn mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem wie autoMACS für CD4 + Zellanreicherung, vorge fließend warmem und Spülen Puffer in einem 37 ° C Wasserbad, um Schäden an der Maschine zu vermeiden. </li><li> HINWEIS: Die Anreicherung wird empfohlen, die Sortierausbeute erhöhen und Sortierzeit. </li><li> AlleHerstellungsschritte, mit Ausnahme für die Präparation sollte in einem sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden. </li></ol> 2. Isolierung von Lymphknoten und Milz von Mäusen <ol><li> Euthanize die erforderliche Anzahl von Tieren mit einem institutionell anerkannte Technik. Verwenden weibliche C57BL / 6 Mäuse im Alter von 5-10 WKS aufgrund ihrer hohen Prozentsatz von naiven T-Zellen und den Körperfettanteil im Vergleich zu Männern oder älteren Mäusen. Hinweis: Zellen von männlichen Mäusen werden in ähnlicher Weise in vitro durchzuführen, und die Protokollschritte bleiben dieselben. Weibliche Mäuse, 5-10 Wochen alt, werden in der Regel ergeben 3-6 x 10 6 naiven CD4 + T-Zellen pro Maus. Jedoch kann unter Verwendung verschiedener Mäusestämme Ausbeute und Leistung beeinflussen. Beispielsweise können Zellen aus C57BL / 6-Mäuse sind besser zur Erzeugung von Th1-Zellen, während Zellen von Mäusen Balb.c besser zur Erzeugung von Th2-Zellen. </li><li> Verbreiten Sie die Gliedmaßen des Tieres und hänge sie an Ort und Stelle, wie in Abbildung 1 dargestellt. Schneiden Sie die Haut langitudinally von den Anus bis zum Kinn, während man aufpassen, nicht zu tieferen Gewebepunktion. </li><li> Verbreiten Sie öffnen Sie die Haut mit einer Pinzette und stecken Sie die Haut an Ort und Stelle, um einen einfachen Zugang zu den Lymphknoten zu ermöglichen, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Ernten Sie die zugänglichen Lymphknoten aus den in Abbildung 1 gezeigten Stellen. Wir packen die Lymphknoten mit einer Pinzette, während Trenngewebe mit einer anderen Pinzette wird für die einfache Entfernung ermöglichen. Legen Sie das Gewebe in der Auffangschale. </li><li> Ernten der Milz aus der in Figur 1 gezeigten Position. In diesem Fall wird vorsichtig Schneid ins Peritoneum benötigt, um Zugang zu der Milz erhalten. Legen Sie das Gewebe in einer Sammlung Gericht. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Gewebe geerntet werden. Ansonsten mit den nächsten Schritten fortfahren. An dieser Stelle führen Sie alle weiteren Schritte auf Eis, bis die Beschichtung der T-Zellen nach dem Sortieren. </li></ol> 3. Gewebeverarbeitung und CD4 + Enrichment<ol><li> Verarbeiten Sie die Lymphknoten und Milz in verschiedenen Gerichten, die Ausbeute als Lymphknotenzellpräparate nicht Erythrozytenlyse erfordern, die zu leichten Leukozyten Tod erhöhen. Daher sind die folgenden Schritte beschreiben ein Verfahren zur Verarbeitung von Milz und Lymphknoten-Populationen getrennt durch Kombination vor der Markierung für die Sortierung folgt. </li><li> Entfernen Sie das Gewebe (Milz oder Lymphknoten gebündelt) von der Auffangschale und in einen neuen 60-mm-Schale mit 3 ml PBS +. Legen Sie ein Quadrat von sterilen Nylon Netz über das Gewebe mit sterilisierten Pinzette. </li><li> Mit der Daumenseite eines Spritzenkolbens (3-10 ml) und sanft zerschlagen das Gewebe gegen die mesh. Nahezu das gesamte Gewebe sollte in Suspension gehen. Sie können auch den Gewebe zwischen zwei autoklaviertem mattierte Folien und geschliffen in Suspension. </li><li> Pipettieren Sie die Aussetzung nach oben und unten ein paar Mal zum Aufbrechen der verbleibende lösliche Klumpen. Legen Sie ein neues quadratisches Stück Nylon-Mesh über die Öffnung ein15 ml konischen Röhrchen und Filtern der Suspension durch, um den verbleibenden Schmutz zu entfernen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für zusätzliche Lymphknoten und Milz-Gewebe. </li><li> Nachdem die Suspension in eine 15ml Tube gefiltert füllen den Rest des Schlauchs mit PBS + und schwenken. Zentrifugiere die Zellen bei 475 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Für die Milzzellen, saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und Zellpellet in 1 ml eiskaltem 1X ACK-Lösung pro Milz für 1 Minute, um Erythrozyten zu lysieren. Dann gibt man 10 ml PBS + auf der Oberseite des ACK, das Röhrchen und zentrifugieren 475 xg für 5 min bei 4 ° C </li><li> Für Lymphknotenzellen, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 2 ml PBS +. Falls gewünscht können diese mit den Milzzellen nach ihrem ACK Lyse und Waschschritt kombiniert werden. </li><li> Saugt den Überstand nach Zentrifugation der Splenozyten und resuspendieren in weiteren 10 ml PBS +. An dieser Stelle kann der Lymphknoten Suspension einauf der Oberseite der Milz Suspension dded wenn zur Sortierung Gewebe Bündelung erforderlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C </li><li> Das Zellpellet kann jetzt CD4 Anreicherung hergestellt werden. Wenn dieser Schritt nicht ausgeführt wird, zu den Sortiervorbereitungsschritte ablaufen. </li><li> Für CD4 Bereicherung mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem, resuspendieren Zellpellet mit CD4-Perlen. Typischerweise 15 &amp; mgr; l Perlen in 85 ul PBS + verdünnt wird verwendet, um das Gewebe zwischen 1 Maus kennzeichnen. Rampe auf das Volumen der Perlen-Mischung nach Bedarf, das Pellet, und Inkubieren für 15-30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS +, vorbei an der Suspension durch Nylon in eine neue 15-ml-Tube, um Schmutz und Zentrifuge wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C zu entfernen </li><li> Das Pellet in 100 ul PBS + pro Maus und fahren Sie mit positiven Selektion auf der Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem. Wenn Sie eine manuelle Trennsystem, follow die Anweisungen des Herstellers für die Anreicherung. Alternativ Resuspendieren der Proben in FACS-Puffer: PBS mit 1 mM EDTA (pH = 8) und 1% BSA, sterilfiltriert. </li><li> Entfernen Sie die positive Fraktion und waschen Sie einmal mit 10 ml PBS +. Das angereicherte CD4 + Bruchteil ist nun bereit für die Sortierung gekennzeichnet werden. </li></ol> 4. Sortier Naive CD4 + T-Zellen <ol><li> Beschriften Sie die Zellpellets mit PBS + mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD62L, CD44, CD25 und CD4 gerichtet. Bei Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Antikörper werden Verdünnungen für jeden zur Verfügung gestellt. Zur Färbung wird ein Volumen von 100 ul der Antikörpercocktail pro Geweben von einer Maus. </li><li> Das Pellet in Antikörper-Cocktail und Inkubation für 15 bis 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 10 ml PBS + und Zentrifuge 475 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Übergeben Sie die Mischung über eine andere Nylonfilter oder Zellsieb Kappe neubewegen alle übrig gebliebenen Trümmer. Pipettieren markierten Zellen in eine Röhre, die für den Zellsortierer kompatibel ist. Halten Sie Zellen auf Eis und von der Licht bis die Art geschützt. </li><li> Bereiten Sammelröhrchen durch Pipettieren 1-2ml kompletten RPMI Medium oder FBS in den Boden der Röhrchen zum Sammeln kompatibel auf einem Zellsortierer. </li><li> Sortieren Sie die naiven CD4 + T-Zellen als CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - Population (Abbildung 2). Waschen der gesammelten Zellen mit vollständigem RPMI-Medium und Zentrifugieren wie oben beschrieben. </li><li> Das Pellet in komplettem RPMI, zählen die naive Zellen, und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol> 5. Einrichten des In-vitro-Differenzierung <ol><li> Absaugen Vertiefungen der anti-CD3 und anti-CD28-beschichteten Platten und Waschen jeder Vertiefung mit 1 ml sterilem PBS (ohne FBS). Für Platten mit 48 Vertiefungen, die Platte 0,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml RPMI. Für Platten mit 24 Vertiefungen, die Kultur 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 1,0 ml RPMI. </li><li> Wenn die Prüfung des Einflusses eines Faktors, wie ein Arzneimittel hinzuzufügen der Substanz in die entsprechenden Vertiefungen entweder vor, während oder nach dem Differenzierungsprozeß je nach Experiment. Weiter, ergänzen die Kulturmedien mit entsprechend Zytokinen und blockierende Antikörper. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 und 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml löslich 37.51, und 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. HINWEIS: Die oben dargestellten Bedingungen als optimal für die Maximierung der Produktion von Zytokinen, wie am Ende des Differenzierungs Experiment (Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) gemessen werden. Allerdings sollte jede Bedingung für einzelne Laboratorien (Tabelle 2 optimiert werden </strong&gt;). Weiterhin ist der Zusatz von löslichem Anti-CD28 neben der Platte gebundenen Anti-CD28 wurde gefunden, dass Th2-Cytokin-Produktion in unserem Labor erweitern, hat keine Auswirkung auf andere T-Zellen-Untergruppen, aber: </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-5 vor der Analyse der Genexpression und Cytokinproduktion d. Alternativ zu entfernen, die Zellen aus den TCR Reize nach 2 d, 1 x 10 6 Zellen / ml mit frischem Medium angepasst, und die Platte in neue Vertiefungen (nicht beschichtet), um die Proliferation und die endgültige Ausbeute verbessern. In diesem Fall, werden frische polarisierenden Cytokine und Antikörper nicht benötigt aber 10 U / ml IL-2 soll auf die neuen Medien für Th0, Th1, Th2 und iTreg Kulturen hinzugefügt. </li></ol> 6. Analyse der Differenzierung <ol><li> Für Cytokin-Analyse durch Durchflusszytometrie restimulieren jede Vertiefung mit 10 ng / ml PMA und 1.000 ng / ml Ionomycin oder 1 &amp; mgr; g / ml anti-CD3 für 4-6 Stunden in Gegenwart eines Golgi-Inhibitor, wie Brefeldin A (Tabelle1). Führen intrazellulärem Zytokinfärbung je nach Experiment (Figur 3). Hinweis: Beize nicht linienspezifischen Zytokine oder Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise IL-4 (nicht gezeigt) und IFN &amp; gamma; (3) für Th17 Kulturen, für jede Bedingung als Negativkontrolle und als Indikator für die Differenzierung Effizienz. Ferner kann Flecken Foxp3 für Th17 Kulturen als Kehr Entwicklung Treg unter Zusatz von TGFß auftreten. </li><li> Zur Proteinquantifizierung, sammeln die Überstände aus jeder Vertiefung und Assay von zytokinspezifischen ELISA (Figur 3). Wenn es Bedenken, dass der Faktor getestet wurde Proliferation beeinflußt, verglichen mit Kontrollproben, können die Zellen gewaschen, gezählt, normalisiert und dann mit 1 &amp; mgr; g / ml Anti-CD3 für 24 h vor dem Sammeln Stände für ELISA-Assays restimuliert. Wenn Untersuchung IL-4 von Th2 Bedingungen, Waschen und Restimulation notwendig ist, um IL-4 zu entfernen, die l sein kanneftover von der ersten Differenzierung Kultur. </li><li> Für die Genexpressionsanalyse von Echtzeit-PCR, Ernte-Zellen nach der Inkubation, Waschen, zu normalisieren und wieder anzuregen für 2-6 h mit 1 ug / ml des anti-CD3 vor der Ernte mRNA (Abbildung 3). </li></ol>

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J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Während die Milz naiven Th-Zellen enthält, ist der Anteil dieser Population in Lymphknoten viel höher. Eine nicht fachgerechte Ermittlung und Beseitigung Lymphknoten in diesem Protokoll wird in einer schlechten Ausbeute von naiven Zellen führen. Dies kann besonders schwierig bei älteren Mäusen oder männlichen Mäusen, die mehr Fettgewebe haben. Wie in Abbildung 1, die richtige Befestigung und Verstiftung der tierischen Gliedmaßen und der Haut gezeigt werden zur leichteren Visualisierung der zug?...

Das Konzept der verschiedenen Linien oder Teilmengen von CD4 + T-Helferzellen (Th) gibt es schon seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts 1 gewesen. Anerkennung der verwandten Antigen in Gegenwart von kostimulatorischen Signalen resultiert in mehreren Runden der Zellproliferation und die eventuelle Differenzierung in Th-Zellen. Der Typ der Th-Zell während dieses Prozesses erzeugt wird, ist abhängig von der während der Aktivierung 2 vorhanden Zytokin-Umgebung. Anfänglich wurden naiven Th-Zellen vermutlich in 2 unterschiedliche Linien folgenden T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung kostimulatorischen CD28 Ligation und Zytokin-Signalisierung zu polarisieren. Typ-1-Helfer-Zellen (Th1) mit ihren Effektorfunktionen Produktion des IFN Cytokin sowie deren Erfordernis für IL-12-Signalisierung während des Differenzierungsprozesses 3,4 gekennzeichnet. Schließlich wurde entdeckt, dass differenzierte Th1-Zellen eine genetische Profil, das am meisten ausgeprägt auszeichnet b habeny der Ausdruck der T-Box-Familie Transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), die als die Hauptregulator des Th1 genetische Programm 5 ist. Darüber hinaus kann IL-12 sowie IFNy T-bet Ausdruck 6,7 fördern. In der Immunantwort sind Th1-Zellen wichtig für die Wirtsabwehr gegen intrazelluläre Pathogene sowie starke Promotoren von Autoimmunentzündung. Demgegenüber Typ 2-Helfer-Zellen (Th2) erfordern IL-4 für ihre Entwicklung und ihre Effektorfunktion Cytokine, einschließlich IL-4, IL-5 und IL-13, sind für den Antrieb B-Zell-Antworten und sind pathogen Allergie 8, 9. Ähnlich wie Th1-Zellen wurden Th2-Zellen gefunden, um ihre eigenen Master Transkriptionsregulator zum Ausdruck, bezeichnet GATA-3 10,11. Interessanterweise ist das Vorhandensein von polarisierenden Cytokine und die Erzeugung eines spezifischen Th Linie antagonistisch auf die Entwicklung anderer 2,12, was darauf hindeutet, daß nur eine bestimmte Teilmenge Th kann während einer Immunwieder dominantAntwort. Da die Identifizierung der Th1 und Th2-Linien hat weitere Arbeit noch einzigartig Gruppen von T-Helfer-Zellen, einschließlich follikulären helper (TFH), IL-9-produzierenden (Th9) und IL-22-produzierenden (Th22) (kürzlich gezeigt in 13 überprüft). Für die Zwecke der in vitro Differenzierungsexperimente wird dieses Protokoll nur an zwei weiteren Th Subsets konzentrieren, genannt regulatorischen T-Zellen (Treg) und IL-17-produzierenden CD4 + T-Zellen (Th17). CD25 + regulatorische T-Zellen können natürlich (nTreg) im Thymus auftreten; naiven Th-Zellen können auch induziert werden (iTreg) Regulierungs in der Peripherie (in 14,15 prüft) zu werden. Beide Arten von Treg exprimieren eine charakteristische Transkriptionsfaktor, bezeichnet als forkhead Feld P3 (Foxp3), die kritisch für ihre Effektorfunktion Unterdrückungsmechanismen, die lösliche entzündungshemmende Mediatorproduktion, IL-2 -Verbrauch und Zell-Kontakt-abhängige Mechanismen 14,15 enthalten ist. Das Fehlen Foxp3-Expression führt zu einer schweren, Multiorgan-Autoimmunerkrankung bezeichnet Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, X-chromosomale Syndrom (IPEX), was die wichtige Rolle dieses Th Teilmenge der Lösung Entzündung und Regel periphere Toleranz gegen Selbst-Antigene 16. In vitro, naive CD4 + T-Helfer-Zellen hochreguliert Foxp3 und sich verpflichtet, die Treg-Programm nach der Stimulation mit IL-2 und TGF-β 14,15. Es kann mäßige bis erhebliche Plastizität in CD4 + T-Zelllinien, vor allem, wenn man bedenkt, nur Zytokin-Produktion (in 17,18 prüft). Jedoch für die Zwecke der in vitro Differenzierungsprotokollen, werden wir uns mit jeder Untermenge als einmalige Linie. Vor kurzem wurde eine Teilmenge von Th17 Zellen, die den IL-17-Zytokin produziert als einmalige Linie mit proinflammatorischen Funktionen, die während Autoimmunentzündung 19-21 besonders pathogene identifizierten. Th17-Zellen exprimieren eine einzigartige Transkriptionsfaktor, genannt Retinoid bezogenen Orphan-Rezeptor gamma t (RORγt), die die Th17 genetische Programm 22 koordiniert. TGF &amp; bgr; ist durch die Induktion RORγt wichtig für die Erzeugung von Th17 Linie. Allerdings ist die Wirkung von TGF &amp; beta Signalisierungs Vermutlich nur veran Th17 Verpflichtung auf synergizing mit IL-6 (in 12 überprüft). Weitere Studien haben gezeigt, dass eine Vielzahl von anderen Signalen, die positiv regulieren Th17 Vereinbarung, einschließlich IL-1β, erhöhte Natrium und TLR 23-26. Andere Berichte haben vorgeschlagen, daß die pathogenen Th17 Zellen in vivo sind diejenigen, die tatsächlich zu umgehen TGFß Signalisierung und sich stattdessen auf eine Kombination von IL-1, IL-6 und IL-23 für ihre Differenzierung 27 verlassen. Somit kann Th17 Zellen aus einer Vielzahl von Signalwegen abgeleitet werden; für die Zwecke dieses Protokolls, die gemeinsam verwendete (TGFß und IL-6) Weg für Th17 Linienfestlegungvorgestellt. Die im folgenden für alle Effektor Linien beschriebenen Differenzierungsprotokollen beruht auf fixierten Antikörper als Stimuli für die TCR und CD28 über den gesamten Verlauf des Experiments. Allerdings haben andere gezeigt, dass TCR-Aktivierung mit Antigen-präsentierenden Zellen 28 oder vernetzendem Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper mit Hamster-Antikörper für 2 Tage 29 sind auch sehr wirksames Mittel zur Induktion der Erzeugung von verschiedenen Th Teilmengen. Die hier vorgestellte Protokoll baut auf die zuvor berichtete Verfahren zur Isolierung von murinen CD4 + T-Zellen von sekundären lymphatischen Organe 30 und erzeugen Th17 Zellen 31. Ein wichtiger Unterschied ist, dass dieses Protokoll beruht auf der Verwendung eines Zellsortierers, naive CD4 + T-Zellen aus lymphoiden Geweben zu isolieren. Viele Firmen bieten inzwischen schnelle Trennung Kits, die für naive CD4 + T-Zellen anreichern können, die vielleicht die Voraussetzungen f umgehen sein könnenoder Sortier je nach Experiment. Die Methoden und Reagenzien in diesem Protokoll vorgestellt werden sind, was wir routinemäßig und zu finden, um die effektivste. Aber bedenken Sie, dass alternative Reagenzien und Methoden für viele der Schritte im folgenden dargestellt existieren und es ist bis zu den einzelnen Labor, um festzustellen, was am besten für ihre Zwecke zu arbeiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Der Zeitpunkt für die Analyse der Differenzierung in Abhängigkeit von der Th Zustand variieren und getestet, wie die Stärke der T-Zell-Rezeptor-Aktivierung. Nach 2-3 Tagen der Differenzierung, können die Zellen durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um das Ausmaß der T-Zellproliferation zu bestimmen. Wells umfassenden Proliferation und Verklumpung der Zellen, die wahrscheinlich für die Analyse am Tag 4. Differenzierung Bedingungen sich auf die Zugabe von exogenem IL-2, wie Th1 und Th2 ist, wird wahrscheinlich er...

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Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.3K Aufrufe.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Serie: Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...