Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Zusammenfassung

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Kryolamellen aus tiefgefrorenen Gittern von Plasmodium falciparum-infizierten humanen Erythrozyten vorgestellt, das leicht für andere biologische Proben adaptiert werden könnte. Die Grundprinzipien für die Probenvorbereitung, das Fräsen und die Betrachtung von Lamellen sind allen Instrumenten gemeinsam, und das Protokoll kann als allgemeiner Leitfaden für die netzgekoppelte Kryo-Lamellenpräparation für die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) und Kryo-Elektronentomographie (KryoET) befolgt werden. Elektronenmikroskopische Gitter, die die Zellen stützen, werden mit einem manuellen oder automatischen Gefrierschrank in flüssiges, stickstoffgekühltes flüssiges Ethan eingefroren und dann auf einem Lichtmikroskop mit Kryotisch gescreent. Gefrorene Gitter werden in ein Kryo-Rasterelektronenmikroskop überführt, das mit einem fokussierten Ionenstrahl (cryoFIB-REM) ausgestattet ist. Die Gitter werden vor dem Fräsen routinemäßig gesputtert, was die Verteilung des Ladungsaufbaus während des Fräsens unterstützt. Alternativ kann mit einem E-Beam-Rotationsbeschichter eine Schicht aus Kohlenstoff-Platin auf die Gitter aufgetragen werden, deren exakte Dicke genauer gesteuert werden kann. Im Inneren des CryoFIB-REM wird eine zusätzliche Beschichtung einer Organoplatinverbindung über ein Gasinjektionssystem (GIS) auf die Oberfläche des Gitters aufgebracht. Diese Schicht schützt die Vorderkante der Lamelle beim Fräsen, deren Unversehrtheit entscheidend für gleichmäßig dünne Lamellen ist. Die interessierenden Bereiche werden mittels REM identifiziert und das Fräsen erfolgt schrittweise, wobei der Strom des Ionenstrahls reduziert wird, wenn die Lamelle Elektronentransparenz erreicht, um eine übermäßige Wärmeentwicklung zu vermeiden. Ein Gitter mit mehreren Lamellen wird dann unter kryogenen Bedingungen in ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) überführt, um eine Tilt-Serienaufnahme zu ermöglichen. Ein robuster und kontaminationsfreier Arbeitsablauf für die Lamellenpräparation ist ein wesentlicher Schritt für nachgelagerte Techniken, einschließlich zellulärer KryoEM, KryoET und Subtomogramm-Mittelung. Die Entwicklung dieser Techniken, insbesondere für das Herausheben und Mahlen von unter hohem Druck gefrorenen Proben, hat in diesem Bereich hohe Priorität.

Einleitung

Nur der zelluläre Inhalt biologischer Proben <500 nm Dicke) kann durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bei kryogenen Temperaturen effektiv abgebildet werden, wodurch der Probenbereich auf Viren, Prokaryoten, einfache einzellige Organismen und dünnere Regionen größerer eukaryotischer Zellen beschränkt^{wird 1}. Das rasterfokussierte Ionenstrahl-Mahlen (FIB) ermöglicht die Verdünnung dickerer, tiefgefrorener biologischer Proben zu elektronentransparenten Lamellen bei kryogenen Temperaturen (< -150 °C). Die resultierenden Lamellen werden dann zur Visualisierung und tomographischen Datenerfassung in ein TEM übertragen, was hochauflösende 3D-Rekonstruktionen der zellulären und molekularen Merkmale im Inneren von Zellen ermöglicht (für Übersichtsarbeiten siehe Rigort et al., 2012², Oikonomou et al., 2016³, und Wagner et al., 2020⁴).

Das FIB-Fräsen ist aus dem Bereich der Materialwissenschaften hervorgegangen, wo Proben routinemäßig verdünnt werden, um sie für die nachgelagerte Analyse vorzubereiten⁵. Sie wird in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) durchgeführt, das über zwei optische Säulen verfügt: eine herkömmliche Rasterelektronenmikroskopoptik und eine zweite Säule mit Optiken, die in der Lage sind, einen fokussierten Ionenstrahl (FIB) zu erzeugen und fein zu steuern - ein sogenanntes FIB-REM. Auf diese Weise kann ein bestimmter Bereich der Probe durch Ionen abgetragen werden, die von einer Galliumquelle erzeugt werden, wodurch überschüssiges Material entfernt wird und eine Lamelle⁶ zurückbleibt. Der Fräsprozess wird durch REM-Aufnahmen der Topografie der Probe gesteuert, die zur Lokalisierung von interessanten Bereichen und zur Überwachung des Fräsfortschritts verwendet werden. Für biologische Anwendungen ist der Grundaufbau weitgehend derselbe, aber die Vermahlung erfolgt bei kryogenen Temperaturen. Dies erforderte, dass Standard-FIB-REMs so angepasst wurden, dass sie über kryogekühlte Tische verfügen, die konstante Temperaturen und niedrige Oberflächenkontaminationsraten aufrechterhalten, sowie über Luftschleusen, um den Probentransfer ohne Entglasung oder Kontamination zu erleichtern. Die Probenshuttles wurden ebenfalls modifiziert, um die Montage einer Reihe verschiedener Träger im Inneren des KryoFIB-REM zu ermöglichen, darunter TEM-Gitter, Planchetten und Kapillaren. Mehrere Schlüsselgruppen von Forschern waren von zentraler Bedeutung für die Entwicklung dieser Methoden und den kontinuierlichen technologischen Fortschritt in diesem Bereich 7,8,9,10,11,12. Kommerzielle Lösungen für das biologische FIB-Mahlen bei kryogenen Temperaturen sind jetzt in größerem Umfang verfügbar, und das Fräsen von Lamellen am Netz wird bei einer optimierten Probe immer routinemäßiger.

Eine Reihe von Raumtemperatur- und Kryo-EM-Techniken können verwendet werden, um zelluläre Informationen auf allen Ebenen des Lebens zu visualisieren, von ganzen mehrzelligen Organismen mit bescheidener Auflösung über das Verständnis des Kontexts komplexer Prozesse auf zellulärer Ebene und noch detaillierter bis hin zur Bestimmung von in situ Molekulare Strukturen^{13,14,15,16,17,18,19}. Zu den klassischen Raumtemperaturtechniken gehören das Schneiden von fixierten und gefärbten, in Harz eingebetteten Zellen und Geweben durch Ultramikrotomie zur Analyse der zellulären Morphologie mittels TEM (für eine Übersicht siehe Studer et al., 2008²⁰). Es wurden alternative Techniken entwickelt, die die Sekundärelektronenstreuung durch REM nutzen, um die Oberfläche von Blöcken konservierter Zellen abzubilden, bevor das Material entweder mit einem Messer (serielle Blockflächenbildgebung) oder einem fokussierten Ionenstrahl schrittweise entfernt wird^21,22,23. Diese Technik wurde auch erfolgreich bei kryogenen Temperaturen (als Kryo-Volumen-Bildgebung bezeichnet) mit einem KryoFIB-REM an glasartigen, ungefärbten Zell- oder Gewebeblöcken eingesetzt²⁴. Alternativ können dickere Lamellen (~15 μm dick) gefräst und mittels STEM-Bildgebung untersucht werden²⁵. Mit diesen Techniken können ganze Blöcke mit vielen Zellen abgebildet werden, um Populationsinformationen zu sammeln, oder ein ganzes Organ/Organismus kann abgebildet und in 3D rekonstruiert werden. Um jedoch auf hochauflösende molekulare Informationen aus Zellen zugreifen zu können, müssen die Proben in einem nahezu nativen, gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert und daher unter kryogenen Bedingungen präpariert werden. Die Kryo-Elektronenmikroskopie von Glaskörperschnitten (CEMOVIS) ist eine Technik, bei der unter hohem Druck gefrorene Blöcke aus biologischem Material unter kryogenen Bedingungen mit einem Ultramikrotom geschnitten werden. Dabei entstehen Bänder aus Kryoschnitten (40-100 nm dick)²⁶, die an einem EM-Gitter befestigt und im TEM abgebildet werden. Die physikalische Wechselwirkung des Messers mit der Glaskörperprobe verursacht jedoch Spalten- und Kompressionsartefakte, die die Zellstruktur stark verzerren können^27,28,29,30. Dickere Abschnitte sind anfälliger für diese Artefakte, was es unpraktisch macht, Abschnitte zu verwenden, die dicker als ~70 nm sind²⁶. Diese Einschränkung schränkt die 3D-Ansicht der biologischen Struktur im Tomogramm stark ein. Beim FIB-Fräsen bei kryogenen Temperaturen treten diese Probleme nicht auf, sondern es gibt eigene Artefakte, die durch unterschiedliche Mahlraten in Teilen der Probe verursacht werden, was zu unterschiedlichen Dicken innerhalb einer Lamelle führt - dem sogenannten Curtaining. Dieses Problem wird durch das Auftragen einer Organoplatinbeschichtung entschärft, die über ein Gasinjektionssystem (GIS) aufgetragen wird und die Vorderkante der Lamelle während des Fräsens schützt³¹. Die Obergrenze der Probendicke für das On-Grid-FIB-Fräsen wird durch die Fähigkeit definiert, die Probe einzutauchen und gleichzeitig glasig zu halten³², obwohl mit der Einführung von Kryo-Lift-out-Techniken und angepassten Probenträgern für biologische Proben das FIB-Mahlen auch zur Verarbeitung von unter hohem Druck gefrorenen Proben eingesetzt werden kann^31,33,34,35. Darüber hinaus dürfen gefrorene Proben nicht zu dünn sein, da genügend biologisches Material vorhanden sein muss, um eine Lamelle von angemessener Größe zu erzeugen, die genügend Oberfläche bietet, um Kippreihen bei der erforderlichen Vergrößerung zu sammeln. Dieses Problem kann durch das Mahlen von Klumpen kleinerer Zellen wie Bakterien oder Hefen gelindert werden. Die endgültige Lamellendicke (~100-300 nm) wird in der Regel durch die Probenintegrität und die Frässtrategie bestimmt. Dünnere Lamellen eignen sich besser für hochauflösende strukturelle Arbeiten, wie z. B. die Sub-Tomogramm-Mittelung, aber dickere Lamellen enthalten viel größere Zellvolumina, als mit CEMOVIS erreicht werden können, und bieten mehr zellulären Kontext in einer nahezu nativ erhaltenen Probe. Das FIB-Mahlen kann auch verwendet werden, um tiefgefrorene Proteinkristalle für Elektronenbeugungsstudien zu verdünnen³⁶.

Das FIB-Fräsen von Glaskörperzellen ist die Zeit und Mühe wert, wenn die wissenschaftliche Fragestellung hochauflösende molekulare Details von nahezu nativen Proben in situ erfordert. Mit dem Zugang zu mehr Einrichtungen für die routinemäßige Herstellung von Lamellen ist der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt oft die Optimierung der Probe vor dem Fräsen, bei der Zeit genommen werden muss, um sicherzustellen, dass die Probe glasig ist und eine angemessene Dicke aufweist, um robuste und gleichmäßig dünne Lamellen zu erzeugen. Hier wird die Probenoptimierung für das FIB-Fräsen von eingefrorenen menschlichen roten Blutkörperchen beschrieben, die mit Plasmodium falciparum-Parasiten , dem Erreger von Malaria, infiziert sind, aber dieser Ansatz könnte für jede beliebige Probe angepasst werden.