Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist kompliziert und zeitaufwendig. Dieses optimierte Protokoll kann Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und ohne Kosten erzeugen. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion von hPSCs deutlich zu verbessern.
Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird die Krankheitsmodellierung und Zelltherapie bei degenerativen Erkrankungen der Netzhaut erleichtern. Bei der Demonstration des Verfahrens sind wir mit Yuanyuan Guan, einem Doktoranden, und Bingbing Xie, einem Techniker aus dem Labor, zusammen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung von 50 ml ECM-Lösung, indem Sie 1 ml der dritten 50-fachen Stammlösung zu 50 ml DMEM hinzufügen. Dann fügen Sie 1 ml dieser vorbereiteten ECM-Lösung zu jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie das hPSC-Wartungsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und wärmen Sie es für 30 Minuten auf Raumtemperatur vor.
Gießen Sie eine kryogene Durchstechflasche mit hPSCs aus einem Flüssigstickstofftank, indem Sie sie 30 Sekunden lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Desinfizieren Sie es vorsichtig mit einem 75% Alkoholspray und legen Sie es in eine Biosicherheitswerkbank. Übertragen Sie die Zellsuspension aus der Durchstechflasche in eine 15-Millimeter-Tube.
Dann fügen Sie 5 ml vorgewärmtes Wartungsmedium Tropfen für Tropfen mit einer 5-ml-Pipette in das Röhrchen hinzu, während Sie das Rohr vorsichtig schütteln, um die hPSCs zu mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 170 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands mit einer 1-ml-Pipette und lassen Sie etwa 50 Mikroliter Überstand zurück, um den Verlust der Zellen zu vermeiden.
Suspendieren Sie das Pellet mit 1 ml Pflegemedium durch Pipettieren nach oben und unten. Entfernen Sie ECM aus den vorbeschichteten Vertiefungen und fügen Sie jeder Vertiefung 1,5 Milliliter Pflegemedium hinzu. Verteilen Sie dann 0,5 Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung.
Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Platte für mindestens 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Zelladhärenz zu fördern. Wechseln Sie jeden Tag das Medium und die hPSCs bei 80% Konfluenz.
Initiieren Sie am Tag 0 die Differenzierung, indem Sie die 80% Konfluenzzellen aus einer Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen. Sammeln Sie die Zellen mit EDTA-Dissoziationslösung, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1 ml Erhaltungsmedium hinzu, das 10 mikromolare Fluvastatin enthält, um die Zelldissoziation zu stoppen.
Sammeln Sie die Zellen mit einer 1 mL Pipette. Die Zellsuspension wird in eine 100 Millimeter ultratief angebrachte Petrischale überführen und 9 ml Erhaltungsmedium mit 10 mikromolarem Fluvastatin in die Schale geben. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig zweimal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
Dann legen Sie es in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem die Zellen mindestens 24 Stunden kultiviert wurden, beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie 9 ml Wartungsmedium und 3 ml NIM in ein 15-ml-Rohr hinzu.
Die Zellkulturen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und 10 ml der vorgewärmten NIM-Mischung in die Schüssel geben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 60 mal G für 3 Minuten, um die Aggregate zu sammeln. Entfernen Sie dann den Überstand mit einer 5-ml-Pipette und lassen Sie etwa 500 Mikroliter zurück, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.
2 ml der Mischung in das Röhrchen geben und die Suspension wieder in dieselbe Petrischale geben. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig, um die Zellaggregate gleichmäßig zu verteilen. Dann legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator.
Entfernen Sie am 5. Tag ECM aus dem vorbeschichteten Geschirr und fügen Sie jedem Gericht 10 ml vorgewärmtes NIM hinzu. Nehmen Sie die Schüssel mit Ebs heraus und überprüfen Sie die Qualität der EBs unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie hell und rund sind. Sammeln Sie alle EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 5 Minuten ruhen.
Entfernen Sie dann den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 2 ml Medium zurück. Nachdem Sie die EBs gezählt haben, säen Sie sie Tropfen für Tropfen mit einer Dichte von etwa 2-3 EBs pro Quadratzentimeter in beschichtete Schalen mit 10 ml NIM. Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die EBs gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie sie für mindestens 24 Stunden in den Inkubator.
Verwenden Sie eine Wolframnadel oder eine Nadel mit einer 1-ml-Spritze, um die morphologisch identifizierbaren optischen Vesikel zusammen mit dem angrenzenden retinalen Pigmentepithel an den Tagen 28 bis 35 mechanisch zu lösen. Kultur sie in Schwebe. Geben Sie 50-60 optische Vesikel in jede 100 Millimeter niedrige Befestigungskulturschale, die 15 ml RDM für die retinale Organoidbildung enthält.
Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage bis Tag-42. Um die netzhautale Differenzierung einzuleiten, wurden hPSCs in kleine Klumpen dissoziiert und in Suspension kultiviert, die seit Tag 1 EBs bildeten. Am Tag 5 wurden EBs auf die ECM-beschichteten Kulturschalen plattiert und die Zellen wanderten allmählich aus den EBs aus.
Am 16. Tag wurde das Induktionsmedium durch RDM ersetzt, wodurch sich die neuralen Netzhautdomänen bildeten und allmählich aus der Schüssel herausragten, sowie zellbildende optische Vesikel-ähnliche Strukturen, die von RPE-Zellen umgeben sind. Während der Tage-28 bis 35 retinale Organoide, bestehend aus der neuronalen Netzhaut, an einer RPE-Kugel befestigt. Auf einer Seite bildeten sich Zellen.
Als die Netzhautdifferenzierung und -spezifikation voranschritt, produzierten hPSCs Subtypen der neuronalen Netzhaut, die sich allmählich in Schichten anlehnten und die architektonischen Merkmale einer einheimischen menschlichen Netzhaut nachahmten. Retinale Ganglienzellen wurden zuerst aus retinalen Vorläuferzellen erzeugt und in der basalen Seite der Neuro-Netzhaut akkumuliert. Mit diesem Protokoll entwickelten sich Netzhautorganoide zu hochreifen Photorezeptoren mit sowohl reichen Stäbchen als auch Zapfen.
Photorezeptorzellen befanden sich auf der apikalen Seite, während sich amakrine Zellen, horizontale Zellen, bipolare Zellen und Müller-Gliazellen alle in der Zwischenschicht der neuronalen Netzhaut befanden. Die Wichtigsten dieses Protokolls sind die Schaffung einer hohen Qualität von Ebs und die Aussaat mit der richtigen Dichte.
