Wir danken Dr. Leila Shakeri &amp; Dr. Aref Dournaei für ihre kritischen Diskus und Mr. Mohammad Reza Khadem Sharif für seine technische Unterstützung.

Ein. Bereiten Sie die Enzymlösung und Proliferation Medium (PM) <ol><li> Make Collagenase Typ I Lösung: Einwaage Collagenase Typ I (12 mg / ml) und lösen sich in 1 ml PBS und Filter unter Verwendung einer Spritze 0,2 um Filter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei -20 ° C bis benötigt. </li><li> Machen Dispase Lösung: abwiegen Dispase (16 mg / ml) auflösen und in 1 ml PBS und Filter mit einer 0,2 um Spritzenfilter. Dann legen Sie es 15 ml Tube und halten Sie sie bei 4 ° C bis benötigt. </li><li> Make Enzymlösung: 1 ml Kollagenase Typ I-Lösungen (12 mg / ml) und 1 ml Dispase Lösungen (16 mg / ml) in das 2 ml sterilem PBS, die 100 mg / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin. Volle Konzentration von Dispase und Collagenase I in Endvolumen sollte 4 mg / ml und 3 mg / ml, rezeptiv sein. Dann Aliquot dieses Volumen um vier 15-ml-Tube, die jeweils 1 ml Enzymlösung. Jedes Rohr könnte ein Zellstoffkochung verwendet werden. </li><li> Machen Waschlösung: In 100 mg / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin in PBS. </li><li> Machen basischen Medien: Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS und 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin ergänzt. </li><li> Machen Sie das Proliferation Media (PM): Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS, 100 uM L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml ergänzt Streptomycin, 0,25 mg / ml Amphotericin B. </li><li> Machen Odontogene Medien: Alpha modifiziertes Eagle-Medium (α-MEM) mit 10% FBS, 100 uM L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 0,01 uM ergänzt Dexamethason, 5 mM β-Glycerin-Phosphat, 1,8 mM Monokaliumphosphat. </li></ol> 2. Bereiten Menschliche Dental Pulp Tissue for Dental Pulp Stem Cell Isolation <ol><li> Normale menschliche dritte Molaren wurden von Erwachsenen (21-29 Jahre) an der Zahnklinik des Imam Ali im Rahmen genehmigter Institutional Review Board (IRB) gesammelt. </li><li> Zähne wurden in das basische Medium (α-MEM mit 10% FBS ergänzt) platziert und wurden in Labor bei 4 ° C transferiert </li><li> Unter dem sterilen Bedingungen, die innerhalb einer biohazard Laminarströmungshaube, Set-up wurde ein 100 mm Petrischalen für jeden Zahn verarbeitet werden getan. Zahnoberflächen wurden durch 70% Ethanol gereinigt. </li><li> Während der Arbeit in einer der Petrischalen wurde Zahn durch Zahnzange gehalten und mit einer Skalpellklinge wurde verwendet, um sauber aus Debris und Parodontalspalt an den Wurzeln. </li><li> Schmelzzementgrenze wurde langsam durch sterilisiert zahnärztliche Disc, um die Pulpakammer sichtbar zu machen. Es sollte berücksichtigt werden, dass Schneidvorgang langsam durchgeführt werden muß, um eine Überhitzung des reduzieren Zahngewebe werden. </li><li> Pulpagewebe wurde vorsichtig von der Krone und Wurzel getrennt. </li&gt; <li> Pulpagewebe wurde in kleine Stücke mit Hilfe einer Skalpellklinge geschnitten. </li></ol> 3. Menschliche Dental Pulp Isolation <ol><li> Pulp Geweben unterzog entweder enzymatische Spaltung von Pulpagewebe oder direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate für die Isolierung von hDPSCs. </li><li> Enzymatische Dissoziation von Pulpagewebe: <ol><li> Kleine Stücke von Zellstoff Gewebe wurden in Enzym-Lösung für 1 Std. bei 37 ° C überführt Vortex alle 30 min zu helfen Aufbrechen Gewebe. </li><li> Danach wurden große Zellaggregate entfernt und Einzel-Zellsuspensionen wurden erhalten, indem man Zellen durch eine 70-uM Zellsieb. </li><li> Einzelzell-Suspensionen wurden bei 1200 UpM für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. </li><li> Überstände wurden vorsichtig abpipettiert und Pellet wurde in 1 ml Proliferationsmedium (PM) resuspendiert. (Hinweis: FBS in Proliferationsmedium beenden enzymatische dissenschaften.) </li><li> Einzelzell-Suspensionen von Zahnpulpa wurde in 25 cm 2 Kulturkolben mit PM ausgesät und anschließend bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Das Kulturmedium wurde alle drei Tage gewechselt, bis die Zelle Konfluenz erreicht war. </li></ol></li><li> Direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate: <ol><li> Pulp Gewebe wurde in 1-2-mm-Fragmente zerkleinert, und jedes Stück wurde in 25-cm 2 Kulturflaschen mit PM platziert und dann bei 37 ° C in 5% CO 2. Es sollte berücksichtigt werden, dass Gesamtvolumen des PM nach Auswuchs der Zelle muss die Befestigung der Pulpe Stücke für weitere Zelle Auswuchs (2-3 ml pro Flasche) unterstützt werden. </li><li> Medium wurde nach Auswuchs beobachtet. </li><li> Die entwachsen Zellen bei Konfluenz wurden subkultiviert in einem Verhältnis von 1:4 (Durchgang 1). </li></ol></li></ol> 4. Immunphänotypisierung <ol><li> 250.000 Zellen /Rohr von beiden Arten von Zellen in Passage 3 wurden durch PE oder FITC-konjugiertem Anti-Human-Antikörpern mit deren Isotypen für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert. (Anmerkung:. Die Konzentration von Antikörpern, wurde gemäß der Herstellung Protokoll angewendet wird) </li><li> Nach der Inkubationszeit wurden 100 ul PBS oder FACS Verdünnungslösung zu jedem Röhrchen zugegeben und zentrifugiert bei 1.200 rpm für 5 min in dunklen Ort. </li><li> Überstände wurden entfernt und Pellets wurden in 100 ul PBS oder FACS-Verdünnung in dunklen Ort resuspendiert. </li><li> Gezielte Oberflächenmarker (CD-Marker) wurden von BD FACSCalibur ausgewertet. </li></ol> 5. Induktion der Differenzierung von DPSCs in mineralisierten Cells &amp; Quantifizierte Alizarin Red S Assay <ol><li> DPSCs, die entweder durch enzymatische Spaltung von Pulpagewebe (bekannt als DPSC-ED) oder direkte Zell Auswuchs aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG) erhalten wurden, waren subkultiviert für 3 Gänge. </li><li> At Passage 3 wurden die Zellen in einer 6-Well-Platte bei 5.000 Zellen / well Samen. </li><li> Bei Konfluenz von 60% wurden odontogenen Medium durch herkömmliche PM ersetzt. Drei Vertiefungen wurden als negative Kontrolle durch Zugabe Wachstumsmedium blieb. </li><li> Medium alle 3 Tage bis Tag 21. </li><li> Am Tag 21 wurden die Zellen mit PBS gewaschen und wurden durch 1 ml / Vertiefung 10% Paraformaldehyd für 15 Min. bei Raumtemperatur fixiert. </li><li> Dann Paraformaldehyd wurde, sorgfältig und pipettiert Zellen wurden 3 mal (5-10 min für jedes Mal) mit destilliertem H 2 O gewaschen (Hinweis: Vermeiden Sie stören die Monoschicht.) </li><li> Nach dem Waschen wurden 1 ml / Vertiefung Alizarinrot S für 20 min bei Raumtemperatur zugegeben. </li><li> Zellen wurden durch deionisiertes H 2 O viermal (5 min für jede Zeit auf dem Schüttler) gewaschen, um alles zusätzliche Alizarinrot entfernen. </li><li> 1 ml / Vertiefung H 2 O zugegeben, um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Die Platten wurden auf visuelle ins angenommenpection und / oder Bildaufnahme. </li><li> Für Alizarin Red S Quantifizierung Assay wurden H 2 O durch 1 ml 10% ige Essigsäure zu jedem Well der 6-Well-Platte und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln ersetzt. </li><li> Dann wurden Zellmonoschicht / Vertiefung schaben &amp; sowohl Essigsäure und Zellen wurden in die getrennten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. (Hinweis:. Jede Vertiefung sollte Transfer sein in ein separates Röhrchen dh drei Probebohrungen &amp; drei Kontrollvertiefungen für jede ED &amp; OG Gruppen) </li><li> Die Röhrchen wurden 30 Sekunden lang kräftig verwirbelt. </li><li> Erhitzen auf 85 ° C für 10 min. (Hinweis: die Verdunstung zu vermeiden, wurden Röhrchen mit Parafilm versiegelt.) </li><li> Nach dem Erhitzen wurden Rohre in Eis für 5 min übertragen. (Hinweis: Rohre sollten nicht geöffnet werden, wenn sich gekühlt werden.) </li><li> Die Aufschlämmungen wurden bei 20.000 × g für 15 min zentrifugiert. Während Zentrifugieren wurden Alizarin Red Normenbis. </li></ol> Alizarin Red S-Standard wurden zuerst durch Verdünnen der Verdünnungspuffer &amp; verwendet für die Herstellung 2-fach serielle Verdünnungen auf der Basis der Tabelle vorbereitet. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> High Range Konzentration des Farbstoffs </td><td colspan="7"> Low Range Konzentration des Farbstoffs </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> 1 mM </td><td> 500 uM </td><td> 250 uM </td><td> 125 uM </td><td> 62,5 uM </td><td> 31,3 uM </td><td> 15,6 uM </td><td> 7,8 uM </td><td> 3,9 uM </td><td> 1,9 uM </td><td> 0,9 uM </td><td> 0,4 uM </td><td> Leer </td></tr></tbody></table><ol start="16"><li> Nach der Zentrifugation wurden 1 ml Überstand / Rohr in neuen, separaten 1,5 ml Mikro-Zentrifugenröhrchen überführt. </li><li> Der pH wurde mit ~ 375 ul 10 neutralisierten% Ammoniumhydroxid pro Röhrchen. (Anmerkung: der pH Wut sollte 4,1-4,5 sein.) </li><li> 150 ul von Standard &amp; Proben (umfasst separate Tests &amp; Kontrollen) wurden in einem undurchsichtigen Wänden, transparenter Boden 96-well-Platte gegeben. </li><li> Die Absorption wurde bei 405 nm abgelesen und OD-Werte aus den Proben wurden mit Standard-Plot für die weitere Analyse verglichen. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung und Charakterisierung von hDPSCs von Zahnpulpa mit zwei Methoden, enzymatische Dissoziation und direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate. Zusätzlich wird in vitro Differenzierung dieser Zellen in Odontoblasten, wurde durch quantitative Alizarinrot S &amp; Assay QPCR beurteilt. Bestehenden Protokollen zur Isolierung Pulpagewebe aus menschlichen Zahns worden verschiedenen Instrumente wie Zangen (Knochenzange) 9, E...

Stammzellen sind Zellen, die klonogenen zwei bemerkenswerte Features, wie Multi-Potenz und Selbst-Erneuerung 15 bekannt zu besitzen. Unter allen Stammzellen mit verschiedenen Potenzen replikativen haben dentalen Stammzellen als die postnatale Stammzellen Aufmerksamkeit in den letzten Jahren ziehen wegen ihrer Zugänglichkeit, Plastizität und hohe proliferative Fähigkeit im Vergleich zu anderen adulten Stammzellen 16. Charakteristischerweise ähnlich zu den mesenchymalen Stammzellen sind Zahnpulpa Stammzellen adhärenten Zellen, die mehrfache klonogenen Differenzierungskapazität in Mesenchym und / oder nicht-Mesenchym Abstammungslinien, sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen. 1-8,17,18 DPSCs werden identifiziert durch ihre negative Ausdruck von hämatopoetischen Antigene (zB CD45, CD34, CD14) und positive Expression CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 und STRO-1. 19,20 Leicht erhalten Potenzial mit minimalen Schmerzen und Morbidität zu menschlichen DPSCs als wertvolleLage Quelle von MSCs zu den gewöhnlichen Quellen, wie Knochenmark mesenchymale Stammzellen 21 verglichen. Im Allgemeinen haben sich entweder durch Auswachsen DPSCs Verfahren, dh Migration von Stammzellen aus Zellstoff Gewebeexplantate (DPSC-OG) 22-24, und / oder durch enzymatischen Verdau (DPSC-ED) 4,6,25 isoliert worden. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Isolierungsmethode und Kulturbedingungen können verschiedene Populationen oder Linien unter in vitro Durchlässe 26,27 induzieren. Im Fall der zweiten Zähne (pDPSCs), Huang et al offenbart, dass die enzymatische verdaut pDPSCs höheren Proliferationspotential haben im Vergleich zu den herausgewachsen DPSCs. 26 zudem im Falle von Milchzähnen (dDPSCs), es wurde nachgewiesen, dass STRO-1 &amp; CD34 Marker Ausdruck mehr in dDPSC-ED im Vergleich mit dDPSC-OG. Darüber hinaus erscheint dDPSC-ED höheren Mineralisierungsgeschwindigkeit in definierten osteo / odonto Medium. 27 Daher ist aufgrund der hervorragenden Potenzial DPSCs in regenerative Medizin, werden weitere Studien zum besseren Verständnis der möglichen verschiedenen Populationen, die aus verschiedenen Isolierungsverfahren abgeleitet sind erforderlich. Hier war es Versuch einfache Art Pulpenextraktion einzuführen, indem in einem Schritt dentalen Diamantscheibe um den Prozess der Pulpenextraktion erleichtern. Darüber hinaus wurde nach der Isolierung von menschlichen Zellstoff-Stammzellen durch Anlegen ED oder OG Methoden wurden allgemeinen Eigenschaften &amp; Differenzierungskapazität zwischen zwei Gruppen ebenfalls untersucht.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog oder Lot. Anzahl </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-100MG </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum definierten (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure-2-Phosphat </td><td> Sigma </td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β-Glycerol Dinatriumsalz-Hydrat, BioUltra </td><td> Sigma </td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td> Monobasischem Kaliumphosphat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Osteogenesis Assay Kit </td><td> Millipore </td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG2b-PE Isotypenkontrolle </td><td> BD Pharmingen </td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC Maus IgG2b Isotyp-Kontrolle </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Maus IgG1 κ Isotyp </td><td> BD Pharmingen </td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PE Maus-Anti-Human-CD34/CD45 </td><td> BD Pharmingen </td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Anti-Human CD146 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonalen Maus-Anti-Human-CD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PE Maus anti-human CD73 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-h CD105/Endoglin PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PE-Maus Anti-Human CD11b/Mac1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44 PE Maus anti human </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatpufferlösung (PBS) </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70-um Zellsieb </td><td> Falke </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 0,2 um Spritzenfilter </td><td> Millex-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25 cm 2 Kulturflasche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> BD FACSCalibur </td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Multiskan Mikrotiterplatten-Spektrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Fleurcense Mikroskop </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fließende Software Version 2.3.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods

<p class="jove_content"&gt; Entwicklung Weisheitszähne sind leicht zugängliche Quelle von Stammzellen während der Erwachsenenalter, die durch Routine kieferorthopädischen Behandlungen erhalten werden konnte. Menschliche Zellstoff-Stammzellen (hDPSCs) besitzen eine hohe Proliferationspotential mit Multi-lineage Differenzierungspotenzial im Vergleich zu den gewöhnlichen Quelle von adulten Stammzellen<sup&gt; 1-8</sup&gt;; Daher hDPSCs konnten die gute Kandidaten für autologe Transplantation im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin sein. Neben diesen Vorteilen besitzen die mesenchymalen Stammzellen (MSC) Funktionen wie immunolodulatory Wirkung machen hDPSCs wertvoller, selbst im Fall von Allograft Transplantation<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;. Daher ist der erste Schritt für die Verwendung dieser Quelle von Stammzellen, um die beste Protokoll zur Isolierung von hDPSCs Pulpagewebe auszuwählen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, die Wirkung verschiedener Trennung Bedingungen auf unterschiedliche zelluläre Verhaltensweisen wie ihre gemeinsame Oberflächenmarker &amp; auch ihre Differenzierungsfähigkeit zu untersuchen.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; So, hier sind wir trennen menschlichen Pulpagewebe aus beeinflusst dritten Backenzähne, und dann verwendet werden sowohl bestehende Protokolle auf Literatur, zur Isolierung hDPSCs,<sup&gt; 11-13</sup&gt;<em&gt; Dh</em&gt; Enzymatischen Spaltung von Pulpagewebe (DPSC-ED) oder Auswuchs aus Gewebeexplantate (DPSC-OG). In dieser Hinsicht haben wir versucht, die Trennung Methoden mit zahnärztlichen Diamantscheibe erleichtern. Dann werden diese Zellen im Hinblick auf Stromazellen-assoziierte Marker (CD73, CD90, CD105 und CD44), hämatopoetische / endothelialen Marker (CD34, CD45 und CD11b), perivaskuläre Marker, wie CD146 sowie STRO-1 gekennzeichnet. Anschließend wurden diese zwei Protokolle basierend auf der Differenzierung Potenz zu Odontoblasten sowohl durch quantitative Polymerasekettenreaktion (QPCR) &amp; Alizarinrot Färbung verglichen. QPCR wurden für die Bewertung der Expression der Mineralisierung Genen (; ALP, extrazellulären Matrix phosphoglycoprotein; MEPE &amp; Dentin Sialophosphoprotein; DSPP alkalische Phosphatase) verwendet.<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> DPSCs, die durch enzymatische Spaltung (DPSC-ED) erhalten wurden, werden hier am Tag 10, 15,18 (Figur 1) dargestellt. Die Kolonien eingeleitet, auf fast 3 bis 5 Tagen nach der Isolierung zu bilden. </li><li> Entwachsen DPSCs (DPSC-OG) sind in Abbildung 2 an Tag 5, 10, 13 und 18 dargestellt. Fibroblast-ähnliche Zellen aus Pulpagewebe in den Kolben wandern begann parallel Bestellung um fast 5 Tage nach der Aussaat. </li><li> DPSCs bei Passage 3 mit beiden Methoden sind in Abbildung 3 dargestellt...

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung entweder<strong&gt; Enzymatische Dissoziation von Zellstoff (DPSC-ED)</strong&gt; Oder<strong&gt; Direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG). Dann gefolgt von</strong&gt;<em&gt; In vitro</em&gt; Vergleichende Unterscheidung der beiden Arten von hDPSCs zu Odontoblasten.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

isolation-characterization-comparative-differentiation-human-dental

Research

JoVE Journal

Medicine

26.2K Aufrufe.  Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran. Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung entweder Enzymatische Dissoziation von Zellstoff (DPSC-ED) Oder Direkte Folge von Stammzellen aus Pulpagewebe Explantate (DPSC-OG). Dann gefolgt von In vitro Vergleichende Unterscheidung der beiden Arten von hDPSCs zu Odontoblasten.

Serie: Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Forschung

Medizin

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow transplantation. While UCB has several unique advantages, the limited numbers of HSCs within each UCB unit limits their use in regenerative medicine and HSC transplantation in adults. Efficient expansion of functional human HSCs can be achieved by ex vivo culturing of CD34+ cells isolated from UCBs and treated with a deacetylase inhibitor, valproic acid (VPA). The protocol detailed here describes the culture conditions and methodology to rapidly isolate CD34+ cells and expand to a high degree a pool of primitive HSCs. The expanded HSCs are capable of establishing both short-term and long-term engraftment and are able to give rise to all types of differentiated hematopoietic cells. This method also holds potential for clinical application in autologous HSC gene therapy and provides an attractive approach to overcome the loss of functional HSCs associated with gene editing.

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Here, we describe the ex vivo expansion of hematopoietic stem cells from CD34+ cells derived from umbilical cord blood treated with a combination of a cytokine cocktail and VPA. This method leads to a significant degree of ex vivo expansion of primitive HSCs for either clinical or laboratory applications.

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central nervous system (CNS). However, further optimization of these technologies would benefit from methods allowing rapid and streamline determination of the extent of CNS and cell-specific targeting upon administration of viral vectors or nanoparticles in the body. Here, we present a protocol that takes advantage of the high throughput and multiplexing capabilities of flow cytometry to allow a straightforward quantification of different cell subtypes isolated from mouse brain or spinal cord, namely microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and endothelial cells. We apply this approach to highlight critical differences between two tissue homogenization methods in terms of cell yield, viability and composition. This could instruct the user to choose the best method depending on the cell type(s) of interest and the specific application. This method is not suited for analysis of anatomical distribution, since the tissue is homogenized to generate a single-cell suspension. However, it allows to work with viable cells and it can be combined with cell-sorting, opening the way for several applications that could expand the repertoire of tools in the hands of the neuroscientist, ranging from establishment of primary cultures derived from pure cell populations, to gene-expression analyses and biochemical or functional assays on well-defined cell subtypes in the context of neurodegenerative diseases, upon pharmacological treatment or gene therapy.

We present a flow cytometry method to identify simultaneously different cell types retrieved from mouse brain or spinal cord. This method could be exploited to isolate or characterize pure cell populations in neurodegenerative diseases or to quantify the extent of cell targeting upon in vivo administration of viral vectors or nanoparticles.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...