Dieses Protokoll kann Echtzeitkinetik auf Einzelzellebene erfassen. Wir können einzelne Zellparameter als Reaktion auf eine HIV-Infektion messen und frühe Signalereignisse mit verzögerten Schritten des viralen Lebenszyklus in Verbindung bringen. Dies ist eine integrierte, skalierbare Alternative zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden mit einer neuartigen optofluidischen Plattform für Einzelzellsortierung, Kultivierung, Bildgebung und Softwareautomatisierung.
Dies ist die erste etablierte Methode für nanofluidische, hochdurchsatzige, longitudinale Einzelzellkultur und Bildgebung. Diese Technik kann breit eingesetzt werden, um zelluläre Signalkinetik und dynamische molekulare Interaktionen in einer Vielzahl von Krankheitszuständen zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um zu vermitteln, wie das Experiment aufgebaut ist, wie Zellen optisch in Stifte sortiert werden und wie Infusionen durch den Chip eingerichtet werden.
Bereiten Sie zunächst eine frische Fluo-4 AM-Ladelösung vor, indem Sie 25 Mikroliter 100X konzentriertes Reinigungsmittellösungsmittel und 2,5 Mikroliter 1.000X Fluo-4 AM in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und dann Wirbel mischen. 2,5 Milliliter Nährmedien in die Ladelösung pipetten und zum Mischen invertieren. Zentrifugieren Sie zwei Millionen MT-4-Zellen bei 500 mal G für drei Minuten, entfernen Sie dann das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern der vorbereiteten Fluo-4 AM-Ladelösung.
Pipetette re-suspendierte Zellen in eine 35 Millimeter Petrischale. Bei 37 Grad Celsius 15 bis 30 Minuten inkubieren und dann weitere 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen geben und die Zellen drei Minuten lang bei 500 mal G zentrifugieren, dann den Überstand entfernen.
Das Zellpellet wird durch Pipettieren in einem Milliliter des Kulturmediums wieder aufgebläsen und bei 500 mal G zentrifugiert, um drei Minuten lang zu waschen. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch Pipettieren im Kulturmedium in einer Konzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter für mindestens 50 Mikroliter. Um einen Chip mit der Benetzungslösung vorzubereiten, der das Zellpfing erleichtert, laden Sie Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern Benetzungslösung und 50 Milliliter entionisiertem Wasser mit einem neuen optofluidischen Chip auf das Instrument und führen Sie die Nasschipfunktion aus, die den Chip mit der Benetzungslösung überflutet.
Inkubieren Sie den Chip bei 50 Grad Celsius und spülen Sie den Chip dreimal mit Wasser. Sobald die Wasserspülung abgeschlossen ist, spülen Sie den Chip mit drei Zyklen von 250 Mikrolitern Nährmedien. Ergänzen Sie die Zellsuspension aus dem vorherigen Schritt mit einem pro 100 Teile F127-Waschmittel gelöstem Stoff vor der Beladung, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Zellen an den Chipkanälen haften.
Verwenden Sie die Instrumentenexportnadel, um Zellen aus einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr mit dem Lastbetrieb und dem Import kleiner Mengen für ein Zellpaketvolumen von fünf Mikrolitern zu importieren. Stiftzellen mit einer optimierten optoelektronischen Positionierung oder OEP-Spannung von 4,3 Volt und fünf Mikrometern pro Sekunde Käfiggeschwindigkeit unter Verwendung der Auto-Pen-Funktion, die einzelne Zellen automatisch erkennt, sie mit einem OEP-Käfig umgibt und sie in einen nahe gelegenen Stift bewegt. Wenn nach dem automatischen Penning noch interessante Zellen übrig bleiben, verwenden Sie die manuelle Stiftfunktion, um Zielzellen und einen Zielstift auszuwählen.
Sobald das Penning abgeschlossen ist, spülen Sie den Chip mit drei Zyklen von 250 Mikrolitern Nährmedien, um alle verbleibenden nicht verbrauchten Zellen vom Chip zu befreien. Nach dem Penning von Zellen erhalten Sie fluoreszierende Bilder von Zellen in FITC-, Texas Red- und DAPI-Kanälen, um die Ausgangswerte Fluo-4, mCherry und Autofluoreszenz zu messen. Infundieren Sie HIV-1 in einer Konzentration von 13 Nanogramm HIV-1 NLCI pro zwei Millionen Zellen in den Mikrochip, indem Sie die Suspension langsam durch die Exportnadel in den Chip pipettieren.
Unmittelbar nach der HIV-1-Zugabe erhalten Sie wiederholt Bilder in den FITC- und DAPI-Kanälen über einen 10-minütigen Zeitverlauf. Erhalten Sie Bilder in den Texas Red- und DAPI-Kanälen ein, zwei, drei und vier Tage nach der Infektion. Diese Methodik wurde für die Identifizierung und Clusterung von HIV-infizierten und nicht infizierten Zellen mittels mCherry-Messung verwendet.
Zellen mit einer Änderung des mCherry-Signals größer oder niedriger als 40.000 mittlere Fluoreszenzintensität wurden in die mCherry High bzw. mCherry Low Population gruppiert. Diese Cluster wurden auf Kalzium-Zuflusskinetik analysiert, indem intrazelluläres Kalzium mit Fluo-4-Fluoreszenz wiederholt über einen neunminütigen Zeitverlauf gemessen wurde, was einen frühen Kalziumzustrom in HIV-infizierten Zellen zeigte. Es wurde eine signifikante positive Korrelation zwischen Kalziumzufluss und mCherry-Floreszenz beobachtet.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit den Zellen innerhalb des exponentiellen Wachstumsbereichs sowohl für die Virusproduktion als auch für die Infektion zu beginnen, da überwachsene Zellen zu einer dramatischen Abnahme des Signals dieses Assays führen. Die Arbeit mit HIV-1 kann gefährlich sein. Daher sollten BSL-2-Praktiken, wie im OSHA Bloodborne Pathogen Standard angegeben, während dieses Verfahrens immer durchgeführt werden.
Diese Technik ist spannend, weil sie es uns ermöglicht, einzellige phänotypische oder transkriptionelle Veränderungen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Dies hat ein breites Potenzial, den Einfluss von Reizen auf molekulare Signalwege in vielen Zelltypen zu korrelieren.
