HIV-1 uncoating Studien in den Aiken Labor wurden von NIH gewährt AI40364, AI50423 und AI076121 unterstützt. Mehrere wichtige Materialien, einschließlich Reagenzien in der p24 ELISA verwendet wurden, wurden durch die NIH AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH zur Verfügung gestellt.

1. Produktion von HIV-1 Partikel Bevor Sie fortfahren, müssen Sie eine Genehmigung erhalten und befolgen Sie die Anweisungen aus dem Biosafety Büro Ihrer Institution in einem Biosafety-Anlage für infektiöse HIV genehmigten Arbeitsprogramms. Sie müssen sicherstellen, dass die richtige Pflege und Sicherheitshinweise sind während der Arbeitszeit in der Biosicherheit Labor. Produktion von HIV-1 Partikel ist in der Regel durch transiente Transfektion von 293T-Zellen mit HIV-1 Provirus-DNA mit Hilfe eines Calciumphosphat-Transfektion Methode 7, 8 durchgeführt. Hohe Titer Virusstocks durch Kultur von infizierten T-Zellen gezüchtet sind ebenfalls geeignet. <ol><li> Kultur 293T-Zellen in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und ergänzt mit Antibiotika [Penicillin (100 IU / ml) und Streptomycin (100 ug / ml)] bei 37 ° C, 5% CO 2 . </li><li> Lösen Zellen aus nahezu konfluenten Gerichte mit 0,25% Trypsin-EDTA und Saatgut 2x10 6 </sup&gt; Zellen in 9 ml pro 100 mm Kulturschale einen Tag vor der Transfektion. Seed sechs 100 mm Kulturschalen für die Produktion von Virionen. Wenn konzentrierte Vorbereitung von Kernen benötigt wird, könnte mehr Gerichte für die Transfektion ausgesät werden. </li><li> Am nächsten Tag sollte der Zellrasen werden etwa 25% konfluent und bereit für die Transfektion. Seit sechs Gerichte der Zellen transfiziert werden, bringen 120 pg Provirus-DNA bis zu einem Volumen von 2,7 ml mit sterilem Wasser. Zu dieser Mischung hinzu 0,3 ml von 2,5 M CaCl 2 und 3 ml 2XBBS, und mischen Sie richtig durch und Abpipettieren mehrmals. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10-20 Minuten stehen lassen. </li><li> 1 ml der resultierenden Mischung tropfenweise in die Mitte von jedem Gericht, während vorsichtiges Schwenken mischen. Die Schalen werden über Nacht (~ 16 Stunden) in einem Inkubator eingestellt bei 35 ° C und 3% CO 2. </li><li> Absaugen des Kulturmediums und sanft mit 5 ml PBS. </li><li> Absaugen PBS und 5 ml frisches Medium. Kultur der Zellen im Brutschrank bei 37 &amp;deg; C und 5% CO 2 für zusätzliche 24-48 Stunden. </li><li> Sammeln Sie die Kulturüberstand mit viralen Partikeln, die Übertragung auf einen 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Kombinieren Sie die Überstände von allen Gerichten und Zentrifuge bei 1.500 xg für 5 min auf Pellet-Zellen und Trümmer. Den Überstand mit 0,45 um Porengröße Spritzenvorsatzfilter. Es sollten Vorkehrungen getroffen, um die Bildung von Aerosolen zu minimieren und gleichzeitig die Zusammenarbeit mit der Live-Virus sein. Dies beinhaltet die Nutzung des konischen Röhrchen mit O-Ringen oder Rotor Eimer deckt während der Zentrifugationsschritt. Wenn dies nicht möglich ist, sollten die Verschlusskappen der Tuben mit Parafilm umwickelt werden. </li></ol> 2. Die Konzentration von HIV-1 Virionen durch Ultrazentrifugation <ol><li> Setzen Sie den Kulturüberstand (30 ml) in einem 38,5 ml Polyallomer Zentrifugenröhrchen (für Beckman SW32Ti Rotor oder gleichwertig). Gently Unterlage das Virus enthaltende Überstand mit 5 ml Lösung von 20% Saccharose in PBS mit einer 5 ml Pipette. </li><li> Zentrifuge für 3 Stunden bei32.000 rpm bei 4 ° C (175.000 xg und r max) zu Pellets Viruspartikel. </li><li> Entfernen Überstände durch Absaugen, dabei nicht auf die Pellet am Boden des Röhrchens zu stören. 0,5 ml 1XSTE Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) auf die Tube und bei 4 ° C für 1 Stunde, um das Pellet zu lösen. Mit einer breit Bohrung 1 ml Pipettenspitze vorsichtig pipet nach oben und unten ein paar Mal, um das Pellet aus dem Boden des Röhrchens zu lösen. Als nächstes übertragen Sie die gelösten Pellets in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, kümmert Schaumbildung zu vermeiden. Inkubation bei 4 ° C für weitere 1-3 Stunden, damit der kleine Klumpen von Viren zu zerstreuen. Während dieser Zeit bereiten die Saccharose-Gradienten wie in Schritt 3.1 beschrieben. </li><li> Vorsichtig pipet die Virussuspension nach oben und unten mehrere Male, und Zentrifuge bei 8.000 Umdrehungen pro Minute (6.000 xg) bei 4 ° C in einem gekühlten Mikrozentrifuge für 1 min zu entfernen verbleibende Klumpen. Halten Sie die Probe kalt während dieses Prozesses. </li></ol> 3. Saccharose-GradientenZentrifugation, um Kerne zu isolieren HIV-1-Kerne werden getrennt mit einem &quot;spin-thru&quot;-Methode 9, die eine Änderung der zuvor beschriebenen Verfahren zur Reinigung von HIV-2-Kerne 10 ist. <ol><li> Bereiten Sie eine 12 ml linear um 30% auf 70% Saccharose-Gradienten in 1XSTE Puffer in einem 14,5 ml Polyallomer Zentrifugenröhrchen für SW32.1Ti Rotor. Zur Vorbereitung Gradienten, verwenden Sie eine 20 ml Gradienten ehemaligen, Platz 6 ml 70% Saccharose-Lösung auf der uns zugewandten Seite (in der Nähe der Austrittsöffnung) und 6 ml 30% Saccharose-Lösung auf der anderen Seite. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Kanal zwischen den beiden Kammern eingeschlossen. Verwenden Sie das Auto Densi-Flow Gradientenformer zu den Gradienten von unten nach oben in der Röhre mit 1 ml 85% Saccharose-Lösung am Boden zu pumpen. Sanft statt dem Gradienten bei 4 ° C abgekühlt, bis (2-4 Stunden). </li><li> Mit einer breit Bohrung 1 ml Pipettenspitze vorsichtig Overlay die Steigung mit 0,25 ml 15% Saccharose-Lösung in STE mit 1% Triton X-100. </li&gt; <li> Gently Overlay mit 0,25 ml 7,5% Saccharose-Lösung in STE mit einem breiten Bohrung 1 ml Pipettenspitze. Achten Sie darauf, um die Schichten zu mischen. </li><li> Gently Overlay mit 0,5 ml Virussuspension von Schritt 2.4. Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden, um jede Störung in der Steigung und Mischen des unterlegten Saccharose Schichten zu vermeiden. </li><li> Legen Sie die Rohre in die vorgekühlte SW32.1Ti Eimer und Zentrifuge auf 32.000 rpm (187.000 xg und r max) über Nacht (16-20 Stunden) bei 4 ° C. Um zu vermeiden, Pausieren der Zentrifuge nicht starten Zentrifugieren, bis das Vakuum in der Zentrifuge erreicht 250 pm </li><li> Sammeln Sie 1 ml Fraktionen von oben nach unten von der Steigung mit dem Auto-Densi-Flow Gradient Fraktionator. Die Röhrchen auf Eis sofort bei der Abholung. Mischen Sie den Inhalt der Rohre durch Invertieren paar Mal, und ziehen Sie 50 ul jeder Fraktion für die Quantifizierung durch ELISA oder Reverse-Transkriptase-Aktivitäts-Assay. </li></ol> 4. Lokalisierung von HIV-1-Kerneund Lagerung der Kerne <ol><li> Vor der Durchführung uncoating Assays, ist es wichtig zu bestimmen, welche Fraktionen erhalten HIV-1-Kerne enthalten. Dies kann durch p24 ELISA oder Reverse-Transkriptase-Aktivitäts-Assay unter Verwendung der 50 ul Aliquots aus Schritt 3.6 bestimmt werden. </li><li> Die Rückgewinnung von CA mit den Kernen lässt sich oft um die Stabilität der Kerne zusammen. Messen Sie den Kern verbunden CA von p24 ELISA 9 mit einer Probe aus jeder Fraktion. Alternativ messen Sie die Reverse-Transkriptase-Aktivität der einzelnen Fraktionen. Mit beiden Methoden der Spitze sollte etwa Fraktion 10 werden. </li><li> Pool der Fraktionen, die Kerne. Wenn die Kerne sind nicht für uncoating Assay sofort Aliquot der gepoolten Kerne in 0,2 bis 0,3 ml Aliquots, flash-freeze in flüssigem N2 und bei -80 ° C eingesetzt werden Cores auf diese Weise eingefroren eignen sich für die uncoating Assay. Die Ausbeute der Kern-assoziierten CA ist in der Regel 1-2 ug von p24 pro Milliliter oder etwa 15% der gesamten Virion-assoziiertenp24. </li></ol> 5. Kinetic Assay von HIV-1 uncoating <ol><li> Die Höhe der HIV-1-Kerne je uncoating Reaktion erforderlich ist, etwa 50 ng. Zur Durchführung der in vitro-Assay uncoating, vorzuverdünnen der Aliquot-Kerne mit dem gleichen Volumen kalten 1XSTE Puffer, um die Viskosität der Suspension zu reduzieren und Pipettieren Fehler zu minimieren. </li><li> Weitere verdünnten 100 ul der Kerne in 0,15 ml kaltem 1XSTE Puffer mit 10 pg / ml BSA in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß. Wir ergänzen die STE-Puffer mit BSA (10 pg / ml) zur Adsorption von CA an die Wände der Röhre zu minimieren. Mix durch Invertieren des Röhrchens mehrmals. Nicht vortexen der Proben. Die Röhrchen in ein Wasserbad bei 37 ° C für Zeitintervallen (15, 30, 60 und 120 min). Die Rohre sollten in das Wasser getaucht mindestens bis auf die Ebene der internen Stichprobe sein, um auch Erwärmung zu gewährleisten. </li><li> Während der Inkubation vorsichtig mischen Sie den Inhalt des Röhrchens in regelmäßigen Abständen (in der Regel 5 -10 min) durch blätterte die Röhre. Für eine Null-Minuten-Steuerung, verdünnte 100 ul der Kerne in 0,15 ml kaltem 1XSTE Puffer und Inkubation auf Eis für die gesamte Länge des Experiments (120 min). Die Null-Minuten-Steuerung gibt dem basalen uncoating Wert und wird verwendet, um Erhöhung der uncoating von Kernen bei 37 ° C für verschiedene Zeitintervalle inkubiert bestimmen. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, stoppen Sie den uncoating Prozess, indem die Rohre in Eis für 10 Minuten. </li><li> Zentrifugieren bei 45.000 rpm (TLA-55 Rotor, 125.000 xg und r max) für 20 Minuten bei 4 ° C. Dies wird Pellet intakten Kernen und den freien CA als Folge der uncoating der Kerne freigesetzt wird im Überstand verbleiben. Der Rotor bei 4 ° C vorgekühlt werden vor dem Laden der Proben. </li><li> Übertragen Sie den Überstand auf neue vorgekühlt Mikrozentrifugenröhrchen vorzugsweise unter Verwendung von Gel-loading Tipps bei Raumtemperatur gelagert. Bitte beachten Sie, dass die Pellets nicht sichtbar für das bloße Auge, so wenden äußerste Sorgfalt an während Pipettieren aus dem Überstand. Resuspendieren der Pellets in 250 ul ELISA Probenverdünner (0,5% Triton X-100 und 5% Donor Kälberserum in PBS). Um eine effiziente Auflösung der Pellet-, Wirbel nach der Zugabe der ELISA Probenverdünner gewährleisten. Quantifizierung der CA Inhalt der Pellet und Überstand mit p24 ELISA wie im folgenden Abschnitt beschrieben. </li><li> Das Ausmaß der uncoating wird durch die Berechnung des Anteils der CA im Überstand erhalten. </li></ol> 6. Assay für CA von p24 ELISA <ol><li> Viele kommerzielle ELISA-Kits sind verfügbar und können verwendet werden, um CA zu quantifizieren. Verwenden Sie einen kommerziellen oder &quot;in-house&quot; ELISA und beinhalten p24-Standards, um die Linearität des Tests zu bestimmen. Verdünnungen der Proben sollte getestet werden, um die Genauigkeit zu gewährleisten. </li><li> Wir haben eine hausgemachte ELISA, die wir routinemäßig Assay für CA Einsatz entwickelt. Das Verfahren ist aus einem früheren Bericht 11 angepasst und wird mit Erfassung und Detektor-Antikörper erhältlich NIH-HILFES Forschung und Reference Reagent Program. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für ein Ergebnis aus ELISA zur Bestimmung von Fraktionen, die Kern ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach dem Sammeln von Fraktionen (1 ml) wurden 50 ul Probe von jeder Fraktion zur seriellen Verdünnungen machen und mittels ELISA. Die gesamte p24, indem die Werte für zwölf Fraktionen betrug 14,5 pg. Wie in der Abbildung Fraktionen 8 bis 10 enthaltenen Kerne gezeigt. Die p24-Wert für die Kern-Fraktionen war 2,17 pg. Der Anteil der Kern-assoziierten p24 (14,97%) wurde durch Bildung des Verhältnisses von p24-Wert für den Kern Fraktionen (2,17 pg) zu den gesamten p24-Wert (14,5 pg) ermittelt. Fraction 1 oder 2 enthält immer höchste Menge an p24, das entspricht freie CA, die nicht mit den Kernen verbunden ist. Dies wird durch eine schrittweise Verringerung der p24-Werte mit jedem weiteren Teil, dann einen starken Anstieg und schließlich ein starker Abfall der p24 gefolgtWerte. Wenn die richtige Pflege genommen wird beim Laden der Gradient dann den Gipfel des Kern-assoziierten CA ist um Fraktion 10 gefunden. Ein typisches Ergebnis durch Testen der Kinetik der uncoating von HIV-1 gewonnenen Bohrkerne wird in Abbildung 2 dargestellt. Die Grafik zeigt eine zeitabhängige Zunahme uncoating von Wildtyp-HIV-1-Kerne. Der prozentuale uncoating Wert wurde durch die Berechnung des Anteils der CA im Überstand erhalten. Mit etwas Übung, ist der Test in hohem Maße reproduzierbar und ist nützlich für die Bestimmung der Stabilität von viralen Cores in vitro. Bitte beachten Sie, dass die Reproduzierbarkeit des Tests stark abhängig von der richtigen Handhabung der Proben während des Verfahrens ist. Da die Kerne hitzelabil sind, sollten die Proben bei 4 ° C während des Tests nur während der Inkubationszeit gehalten werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> Abbildung 1 Equilibrium Dichtegradientenzentrifugation vonHIV-1-Kerne. Eine konzentrierte Virussuspension wurde an die Spitze einer 30 bis 70% linear Sucrosegradienten mit 1% Triton-X-100 überlagert angewendet. Nach über Nacht Zentrifugation bei 187.000 xg und 4 ° C, 1 ml Fraktionen wurden von oben (Fraktion 1) nach unten (Fraktion 12) gesammelt und p24 wurde mittels ELISA quantifiziert. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> Abbildung 2 Zeitlicher Verlauf der HIV-1 uncoating in vitro. Gereinigte HIV-1-Kerne wurden verdünnt und bei 37 ° C für die angegebenen Zeitintervalle. Die Null-min-Probe wurde auf Eis für die gesamte Dauer des Experiments inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben auf 125.000 xg für 20 Minuten bei 4 ° C ultrazentrifugiert Überstand und Pellets wurden getrennt und von p24 ELISA analysiert. Das Ausmaß der uncoating wurde bestimmt, wie im Protokoll Text beschrieben. Jeder uncoating Reaktion wurde doppelt durchgeführt; Fehlerbalken span Bereich der beiden Werte.

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	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebene Methode zur HIV-1-Kerne zu reinigen, um studieren uncoating in vitro ist für das Studium dieser Phase der HIV-1 Lebenszyklus, vor allem aufgrund der Nichtverfügbarkeit eine validierte Methode zur HIV-1 uncoating in Zielzellen zu analysieren nützlich. Obwohl diese Methode verwendet Gleichgewicht Ultrazentrifugation zu Kernen zu reinigen, andere haben direkte Pelletierung nach kurzer Lyse verwendet mit 1% Triton-X-100 12, 13 oder Pelletierung durch eine Saccharose-Kissen mit 0,1% Triton...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Name des Reagenzes </td><td width="197"> Firma </td><td width="114"> Katalog-Nummer </td><td width="161"> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> CellGro </td><td> 21 bis 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Zusammensetzung: 50 mM BES [p H 6.95], 280 mM NaCl und 1,5 mM Na 2 HPO 4. Der pH-Wert auf 6,95bei Raumtemperatur. Filter sterilisieren und lagern in Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Coating-Antikörper: Monoklonale Antikörper gegen p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Programm </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primärer Antikörper: HIV-Ig (hyperimmune menschlichen Patienten Serum) </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Programm </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Sekundäre Antikörper: Anti-Human-IgG, Peroxidase-konjugierten </td><td> Durchstechen </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP-Substrat </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96-Well-Platten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti und SW32.1 Ti Rotoren und kompatibel Ultrazentrifuge </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 Rotor-und Tabletop-Ultrazentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> High speed Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi Flow-Dichtegradienten Fraktionator </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradient Ehemalige </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

Das Genom der Retroviren ist verpackt in einem Kapsid von einer Lipid-Hülle umgeben. Für Lentiviren wie HIV-1, ist die konische Kapsid Schale CA-Protein als ein Gitter aus Sechseck angeordnet sind. Das Kapsid ist um 7 Pentamere auf das breite Ende und 5 am schmalen Ende des Konus 1, 2 geschlossen. Eingeschlossen in diese Kapsid-Shell ist die virale Ribonukleoproteinkomplex, und zusammen umfassen sie den Kern. Nach der Fusion der Virushülle mit der Zellmembran Ziel ist die HIV-1 in das Zytoplasma freigesetzt. Das Capsid dann zerlegt veröffentlicht kostenlose CA in die lösliche Form 3 in einem Prozess genannt uncoating. Die intrazelluläre Ort und Zeitpunkt des HIV-1 uncoating sind weitgehend unverstanden. Einzel-Aminosäure-Substitutionen in CA, dass die Stabilität des Kapsid verändern ebenfalls beeinträchtigen die Fähigkeit des HIV-1 auf Zellen 4 zu infizieren. Dies deutet darauf hin, dass die Stabilität des Kapsid von entscheidender Bedeutung für HIV-1 Infektion ist. </p&gt; HIV-1 uncoating wurde schwer Studie aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von sensitiven und zuverlässigen Tests für diesen Prozess. Hier beschreiben wir eine quantitative Methode zur Untersuchung uncoating in vitro mit Kernen von infektiösen HIV-1 Partikel isoliert. Der Ansatz beinhaltet Isolierung der Kerne durch Sedimentation von konzentrierten Virionen durch eine Schicht von Wasch-und in eine lineare Saccharose-Gradienten, in der Kälte. Zur Quantifizierung uncoating werden die isolierten Kerne bei 37 ° C für verschiedene Zeitintervalle und anschließend pelletiert durch Ultrazentrifugation. Das Ausmaß der uncoating wird durch die Quantifizierung der Anteil der CA in den Überstand analysiert. Dieser Ansatz wurde eingesetzt, um Effekte von viralen Mutationen auf HIV-1 Capsid Stabilität 4, 5, 6 zu analysieren. Es sollte auch für die Untersuchung der Rolle zellulärer Faktoren in HIV-1 uncoating.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer uncoating<em&gt; In-vitro-</em&gt;.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K Aufrufe.  Vanderbilt University School of Medicine. Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer uncoating In-vitro-.

Serie: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...