Wir danken E. Massicotte und J. Herrn für kompetente technische Unterstützung während der Durchflusszytometrie und Zellsortierung Experimenten. Außerdem möchten wir Ihnen für die Bereitstellung von Blutproben danke dem IRCM Klinikpersonal und allen Spendern. Periphere Blutproben wurden von gesunden erwachsenen Spendern, die in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki im Rahmen der Forschungsprotokolle von der Forschungsethik Review Board des Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM) genehmigte schriftliche Einverständniserklärung gaben erhalten. Die folgenden Reagenzien wurden durch die NIH AIDS Reagent-Programm, Abteilung für AIDS, NIAID, NIH erhalten: MT4-Zellen von Dr. Douglas Richman; und Menschen rIL-2 von Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. Dr. Cohen ist der Empfänger des Canada Research Chair in Menschen Retrovirology. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus CIHR (CIHR 111.226) um Dr. Cohen und aus dem Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS-Netzwerk, um Dr. Bego und Dr. Cohen unterstützt.

Allgemeine Hinweise Es ist wichtig zu Zellen in Kultur ohne Antibiotikum zu halten, da selbst gesteuert bakteriellen Infektionen kann durch PBMCs erfasst werden. Eine solche Erfassung von bakteriellen Komponenten wird eine Hintergrund Interferon-Produktion, die nicht von der durch spezifische HIV-1-Erfassungs ausgelöst unterschieden werden kann induzieren. Darüber hinaus haben alle Zellen, die routinemäßig für die Mycoplasmaverunreinigung getestet werden. Verwenden Sie immer Endotoxin-freie Lösungen, wann immer möglich. Durchflusszytometrische Charakterisierung der verschiedenen Zellen, die in den Co-Kulturen verwendet werden, (PBMCs, pDCs, MT4 und CD4 + T-Zellen) ist ein optionaler Schritt, der jedoch sehr zu empfehlen, da sie wertvolle Informationen für die richtige Interpretation einer gegebenen Experiment erforderlich ist. 1. Herstellung der infizierten Zielzellen <ol><li> Pflegen menschlichen CD4 + T-Zelllinie MT4 in RPMI 1640 medimit 10% fötalem Rinderserum (FBS), von nun an als RPMI-1640-Vollmedium bezeichnet eine ergänzt. </li><li> Isolierung von primären CD4 + T-Zellen. <ol><li> Mononukleäre Zellen aus menschlichem peripherem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation. </li><li> Isolieren CD4 + T-Lymphozyten mit einem CD4 + T-Zellen negative Selektion Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Aktivieren CD4 + T-Lymphozyten mit PHA-L (5 &amp; mgr; g / ml) für 48 Stunden und dann aufrechtzuerhalten Zellen in RPMI-1640 Komplettmedium mit rekombinantem IL-2 (100 U / ml) ergänzt. Infizieren primäre T-Zellen 5 Tage nach der Isolierung. </li></ol></li><li> Infektion von Zielzellen (T-Zelllinie MT4 oder heterolog primären CD4 + T-Zellen). <ol><li> Zwei Tage vor der Cokultur, infizieren T-Zellen mit HIV-1-Virus. In dem hier beschriebenen spezifischen Beispiel pNL4.3-GFP_ires_Nef Wildtyp (WT) oder pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) Viren verwendet. Diese Virusstämme stellen green Fluorescent Protein (GFP) -markierte isogenen infektiöse molekulare Klone, die nur in ihrer Fähigkeit, Vpu exprimieren abweichen. </li><li> Verwenden Sie unterschiedliche Infektionsmultiplizitäten (MOIs) und wählen Kulturen mit ähnlichen Niveaus der Infektion für Co-Kulturen. Der Tag der Co-Kultur, den Prozentsatz von GFP + -Zellen mittels Durchflusscytometrie als Marker der Infektion. Verwenden nur die Kulturen mit einem Bereich von 20-50% infizierte Zellen für die Co-Kulturen. </li></ol></li></ol> Optionale Schritte: Führen Sie durchflusszytometrische Färbung an dieser Stelle auf die Oberflächenexpression von Molekülen / Liganden von Interesse, wie BST2 und CD4 bewerten. Für Zeiloberflächenfärbung resuspendieren 0,5 x 10 6 T-Zellen in 100 ul Waschlösung wird mit 1 &amp; mgr; l anti-CD4_PerCP / Cy5.5 und 1 ul Anti BST2_A660. Röhrchen für 45 min Inkubation bei 4 ° C, vor dem Waschen mit Durchflusszytometrie Waschlösung. Wenn die Studien zur Bewertung der Rolle von Vpu-vermittelte BST2 Antagonismus abzielen, führen Sie eine HIV-1-PartikelFreisetzungsassay zu diesem Zeitpunkt, wie zuvor beschrieben 15. 2. Isolierung und Anreicherung von Sensorzellen (Whole PBMCs oder Enriched pDCs) Hinweis: Wenn PBMCs werden zum Abtasten verwendet wird, starten Isolation innerhalb einer halben Stunde nach der Blutentnahme und führen sie in einer fristgerechten Weise. Verwenden PBMCs sofort für Co-Kulturen oder pDC Bereicherung. <ol><li> Mononukleäre Zellen aus menschlichem peripherem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation. Optionaler Schritt: Führen Sie multi-parametrische Durchflusszytometrie-Färbung, um zu bestätigen, dass die frisch isolierten PBMCs enthalten die verschiedenen Zelllinien bei physiologischen Verhältnissen. Für Zeiloberflächenfärbung resuspendieren 10 6 PBMC in 100 ul Blockierungslösung Fc, und Inkubieren für 15 min bei 4 ° C. Nach dem Blockieren wird mit 1 &amp; mgr; l anti-CD3_Pacific Blue (für T-Zellen), 1 &amp; mgr; l Anti-CD14-PE_Texas Rot (für Knochenmarkzellen), 4 &amp; mgr; l anti-BDCA2_APC und 1 ul Anti ILT7_PE (zum pDC). InkubierenRöhrchen für 45 min bei 4 ° C, vor dem Waschen mit Durchflusszytometrie Waschlösung. </li><li> Bereichern pDCs mit einem PDC negative Selektion Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. Es empfiehlt sich, schnell zu arbeiten, halten Zellen kalt, und verwenden Sie vorgekühlte Lösungen. Dies wird die Begrenzung der Antikörper auf der Zelloberfläche und nicht-spezifische Markierung von Zellen verhindern sowie die Gewährleistung maximaler PDC-Aktivität. <ol><li> Zuführen multiparametrischer Durchflusszytometrieanalyse frisch isolierten pDCs auf Reinheit, Prozentsatz der Anreicherung, und die relativen Mengen pDC- spezifischen Oberflächenmarkern (wie ILT7 und BDCA2) bestätigen. Für Zeiloberflächenfärbung resuspendieren 10 4 pDCs in 100 ul Blockierungslösung Fc, und Inkubieren für 15 min bei 4 ° C. Nach dem Blockieren wird mit 1 &amp; mgr; l anti-CD3_Pacific Blau, 1 ul Anti CD14_PE_Texas Rot, 4 &amp; mgr; l anti-BDCA2_APC und 1 ul Anti ILT7_PE. Röhrchen für 45 min bei 4 ° C inkubieren, bevor sie mit Durchflusszytometrie Waschlösung (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Ein Minimum von 40% Reinheit pDC empfohlen (wenn das Ausgangsmaterial 0,4% pDC, wäre dies äquivalent zu einer 100-fachen Anreicherung). </li></ol></li></ol> 3. Co-Kultur von infizierten CD4 + T-Zellen und Sensorzellen (Whole PBMCs oder Enriched pDCs) <ol><li> Mischungs 220 ul PBMCs oder 220 ul pDCs (zu 850.000 Zellen / ml verdünnt) (bei ​​einer Konzentration im Bereich von 100.000 bis 500.000 Zellen / ml) mit 30 &amp; mgr; l der infizierten T-Zellen (10 6 Zellen / ml verdünnt) je Vertiefung in einen U-Boden 96-Well-Platte. <ol><li> Als Kontrollen Platte PBMCs oder pDCs und T-Zellen allein. Anpassen der Lautstärke in gut 250 ul mit RPMI 1640 Komplettmedium. </li><li> Beurteilen zellulären Reaktionen auf bekannte Agonisten der TLR7 und TLR9 Pfade. Zu diesem Zweck Platte 220 ul PBMCs oder 200 ul pDCs (bei einer Konzentration im Bereich von 100.000 bis 500.000 Zellen / ml) pro Vertiefung (bei 850.000 Zellen / ml verdünnt) in einer U-Boden-Platte mit 96 Vertiefungen und fügen TLR7 Agonisten ( Imiquimod, Endkonzentration: 2,5 ug / ml) oder TLR9-Agonisten (ODN 2216 CpG-A, Endkonzentration: 5 &amp; mgr; M). Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 18-22 h auf und verarbeiten sie in ähnlicher Weise wie in den nachfolgend beschriebenen Co-Kulturen. </li></ol></li><li> Co-Kulturen für 18-22 h bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann Übertragung auf einen V-Boden Platte mit 96 Vertiefungen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 x g. <ol><li> Übertragen Sie die Überstände auf eine Flachboden-96-Well-Platte. Überstände können bei -80 ° C gelagert oder bei Typ-I-IFN-Erfassungs sofort verwendet werden. </li><li> Resuspendieren Co-kultivierten Zellen in 2% Paraformaldehyd und Durchflusszytometer analysieren. Aufgrund von Unterschieden in Größe und Granulierung sind MT4-Zellen aus PBMCs oder pDCs basierend auf ihrer Seite Streuung (SS) gegen Vorwärtsstreu (FS) Profile leicht zu unterscheiden. Wenn die primäre T-Zellen als Ziel infizierten Zellen können diese mit beliebigen Zelle tracker Farbstoff angefärbt werden, beispielsweise CSFE vor Kokultur. </li></ol></li><li> Die Messung der bioaktiven Typ-I-IFN mit HEK-Blau IFN-α / β-Reporterzellen. Hinweis: Diese Zellen wurden durch stabile Transfektion von HEK293-Zellen mit den menschlichen STAT2 und IRF9 Genen erzeugt werden, um ein vollaktives Typ I IFN-Signalweg zu erhalten. Sie enthalten auch die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) Reportergen unter der Kontrolle des IFN-α / ß induzierbaren ISG54 Promotors. Stimulation der Zellen mit Typ I-IFN aktiviert den JAK / STAT / ISGF3 Wegs und induziert die Produktion von SEAP. <ol><li> Aufrechtzuerhalten HEK-Blau IFN-α / β-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt. Platte sie in einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einer Flachboden-96-Well-Platte in einem Endvolumen von 180 ul. </li><li> Mit 20 ul Kokultur Überstand in jeder Vertiefung in Duplikat. Jede Platte erfordert auch eine Reihe von internen Standardkontrollen (human IFN alpha, Endkonzentration von 100 U / ml bis 2.500 U / ml). Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2 für 18-22 H. </li><li> Bestimmen Ebenen der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung Quanti-Blau-Lösung, die von rosa nach violett / blau in der Gegenwart des Enzyms ändert. Bereiten QUANTI-Blau folgenden Empfehlungen des Herstellers. Fügen Sie 180 ul dieser Lösung zu jeder Vertiefung einer Flachboden-96-Well-Platte. Zu jeder Vertiefung auch 20 &amp; mgr; l der induzierten HEK-Blau IFN-α / β-Zellen-Überstände hinzuzufügen, und inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator, bis Farbe entwickelt, in den Standard-IFN Kontrollvertiefungen. </li><li> Auszuwerten Ebenen SEAP Verwendung eines Spektrophotometers bei 620 bis 655 nm und bestimmt die Konzentration von Typ-I-IFN durch Extrapolation aus dem linearen Teil der IFN-Standardkurve. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+immunity.">Plasmacytoid dendritic cells in immunity.</a> Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).</li><li>Lepelley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+sensing+of+HIV-infected+cells.">Innate sensing of HIV-infected cells.</a> PLoS pathogens. 7, e1001284 (2011).</li><li>Beignon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+HIV-1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+via+Toll-like+receptor-viral+RNA+interactions.">Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).</li><li>Martinelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+gp120+inhibits+TLR9-mediated+activation+and+IFN-{alpha}+secretion+in+plasmacytoid+dendritic+cells.">HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).</li><li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TLR7/9+responses+in+plasmacytoid+dendritic+cells+by+BST2+and+ILT7+receptor+interaction.">Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction.</a> The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).</li><li>Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-activated+interferon+regulatory+factor+7+upregulates+expression+of+the+interferon-regulated+BST2+gene+independently+of+interferon+signaling.">Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling.</a> Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpu+enhances+HIV-1+virus+release+in+the+absence+of+Bst-2+cell+surface+down-modulation+and+intracellular+depletion.">Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).</li><li>McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpu+binds+directly+to+tetherin+and+displaces+it+from+nascent+virions.">Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions.</a> PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).</li><li>Manel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryptic+sensor+for+HIV-1+activates+antiviral+innate+immunity+in+dendritic+cells.">A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells.</a> Nature. 467, 214-217 (2010).</li><li>Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytosolic+exonuclease+TREX1+inhibits+the+innate+immune+response+to+human+immunodeficiency+virus+type+1.">The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1.</a> Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).</li><li>Fonteneau, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+and+concomitantly+induces+the+bystander+maturation+of+myeloid+dendritic+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells.</a> Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).</li><li>Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+induction+by+HIV-1-infected+cells:+a+possible+role+of+sulfatides+or+related+glycolipids.">Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids.</a> Virology. 221, 113-119 (1996).</li><li>Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-infected+cells+are+major+inducers+of+plasmacytoid+dendritic+cell+interferon+production,+maturation,+and+migration.">HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration.</a> Virology. 343, 256-266 (2005).</li><li>Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+calcium-modulating+cyclophilin+ligand+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+particle+release+and+cell+surface+expression+of+tetherin.">Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin.</a> Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).</li><li>Grouard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+plasmacytoid+T+cells+develop+into+dendritic+cells+with+interleukin+(IL)-3+and+CD40-ligand.">The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand.</a> The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).</li><li>Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection:+striking+a+delicate+balance.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance.</a> Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).</li><li>Bego MG, ., C&#244;t&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohen+&#201;A.+Exploits+the+Cross-Talk+between+BST2+and+the+ILT7+Receptor+to+Suppress+Anti-HIV-1+Responses+by+Plasmacytoid+Dendritic+Cells.">Cohen &#201;A. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).</li></ol>

Die hier beschriebenen Protokolle messen Erfassen von T-Zellen mit GFP-markierten HIV-1-Viren, die nur in ihrer Fähigkeit, Vpu exprimieren unterscheiden, wie in unserem aktuellen Bericht 18 beschrieben infiziert. Allerdings können diese Verfahren leicht modifiziert werden, um Erfassung von unmarkierte Viren sowie Viren, denen anderen viralen Genen, die potentiell modulieren können angeborene Sensor studieren. Wenn die verwendeten nicht GFP exprimieren Viren, sollte der Anteil der infizierten Zielzellen durch andere Mittel vor der Ko-Kultur, wie p24 (Kapsid) intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie oder durch p24-ELISA bestimmt werden. Darüber hinaus können diese Protokolle mit unterschiedlichen Ziel T-Zellen, einschließlich einer Vielzahl von verfügbaren Zelllinien und primäre Zellen verwendet werden. Die in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren weisen eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu den frühen Methoden zur Behandlung von HIV-1-Erfassung zu studieren. In erster Linie wurde von einer Reihe von Gruppen, die zellfreie HIV-1-p etabliertArtikel sind schlechte Induktoren von Typ-I-IFN 2,13,14. Weiterhin verlassen frühen Studien bei älteren IFN ELISA-basierten Verfahren, die Menge an Typ-I-IFN produziert quantifizieren. Eine Beschränkung dieser Detektionstechnik ist, dass die meisten älteren IFN alpha ELISA-Kits messen nur eine Art von IFN alpha, während mit Blick auf die anderen Arten von IFN alpha und IFN &amp; beta. Der Einsatz der beschriebenen Reporterzelllinien überwindet diese Einschränkung, da die Konzentration aller bioaktiven Formen des menschlichen Typ I-IFNs auf einmal gemessen werden. Die Technik ist sehr empfindlich, weniger teuer als die neue Generation von IFN-ELISA-Kits und für viele Spender große Mengen an Typ-I-IFN leicht erkannt werden können. Dennoch kann dieses Protokoll leicht zur Verwendung mit anderen Typ-I-IFN-Ausleseverfahren wie ELISAs angepasst werden. Kritischen Schritte: Es ist wichtig, dass die Qualität aller zellulären Komponenten (beide Ziele und Effektoren) streng kontrolliert werden. Mögliche Kontamination, auch wenn asymptischen, muss überwacht und gesteuert werden. Wie bereits erwähnt, Antibiotikum gesteuerten asymptomatischen bakteriellen Kontamination und möglicherweise andere intrazelluläre Pathogene, wie Mycoplasmen, können ähnliche Immunreaktionen gegen das nach dem HIV-1-Infektion, nämlich Produktion von Typ-I-IFN beobachtet Einsen erzeugen. Darüber hinaus müssen alle Reagenzien frei von LPS oder andere potenzielle Endotoxine zu sein. Ebenso ist die Überwachung der PBMCs und pDCs auch wichtig, da die menschliche Proben oft durch darunterliegenden laufenden Infektionen, die normalen Fühl beeinträchtigen kann grundiert werden. Wir empfehlen, immer einschließlich der vorgeschlagenen negativen Kontrollen, wie Fehlen von Zielzellen als auch Co-Kulturen mit mock-infizierten Zellen. Lebensfähigkeit infizierter Zellen ist auch wichtig für die richtige pDC Erkundung seit Typ-I-IFN haben noch keine Co-Kultur mit apoptotischen Zellen 2,14 hergestellt. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die Notwendigkeit für frisch isolierte primäre Zellen. Dieses Verfahren wurde nichtgetestet mit PBMCs oder pDCs, die entweder zuvor eingefroren oder in Kultur gehalten wurden. Die Isolierung von PBMCs ist arbeitsintensiv und diese Zellen haben eine sehr begrenzte Lebensdauer. Darüber hinaus sollten Standardprotokolle zum Schutz vor durch Blut übertragbaren Erreger verwendet werden, während der Arbeit mit menschlichem Blut. Oft gibt es mehrere Quellen der Variabilität mit Arbeit verbunden mit frisch isolierten menschlichen Zellen. Unter ihnen sind die verschiedenen Verfahren durchgeführt, um diese Zellen zu isolieren und die geerbte Variabilität vom Spender zu Spender aufgetreten. Während es unmöglich ist, um die Variabilität unter den Spender zu vermeiden, ist die Verwendung der vorgeschlagenen positive Kontrollen, wie Mess Reaktion auf bekannte Agonisten des TLR7 und TLR9 Wege, einen wichtigen internen Kontrolle für diese Experimente zu schaffen. Wir haben beobachtet, dass eine robuste Reaktion auf Agonisten des TLR9-Weg konnte ein gesundes pDC Antwort korreliert werden, während ein reaktions TLR7 Weg wird für eine richtige Antwort gegen HIV-1 3 erforderlich. und andere 2, Anreicherung von pDCs aus PBMCs ist häufig nicht erforderlich. Wenn die Versuchsplanung erfordert (zum Beispiel im Kontext, in dem Verarmungs spezifischer pDC Oberflächenmarker ist erforderlich) negative Selektion ist aber über die positive Selektion bevorzugt, als Zellen frei von Antikörper bleiben nach der Auswahl. Isolated pDCs laufen schnelle Apoptose in Kultur. Für Experimente, die diese Zellen benötigen für längere Zeit kultiviert werden können Kulturmedien, die mit IL-3 ergänzt werden. Dieses Zytokin induziert pDC Proliferation und hemmt deren Apoptose 16. Streng kontrolliert werden muss jedoch IL-3 Nutzung, da es zu pDC Reifung oder Differenzierung führen. Die hier beschriebene Methode kombiniert Ziel HIV-1-infizierten Zellen mit frisch isolierten PBMCs oder pDCs, um die ersten Schritte bei der angeborenen Erkundung beteiligt neu zu erstellen. Diese Methode wird zweifellos sinnvoll, explor seine frühen angeborenen Immun Veranstaltungen mit HIV-Infektion assoziiert. Obwohl die damit verbundenen Protokolle werden am Mess Typ-I-IFN richtet, könnten sie leicht modifiziert werden, um andere bioaktive Moleküle aus pDCs bei Erkennung von infizierten Zellen freigesetzt zu messen. Diese können umfassen: Typ-III-IFN (IFN-λ), pro-inflammatorischen Zytokinen (wie TNF-α und IL-6) und der Chemokine CXCL10 CCL4 und CCL5 17.

Typ-I-IFN-Herstellung pDCs stellen die erste Verteidigungslinie gegen virale Infektionen, und als solche dienen als wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immun 1. Während zellfreien HIV-1-Partikeln nur schlecht durch das angeborene Immunsystem erkannt werden HIV-1-infizierten CD4 + T-Zellen wirksam durch pDCs 2 abgetastet. Der Sensormechanismus erfordert einen anfänglichen Kontakt zwischen dem viralen Hüllglycoprotein (gp120) an der Oberfläche der infizierten T-Zellen und CD4-Moleküle auf dem PDC, das dann durch Viruserfassung und Internalisierung durch das PDC gefolgt. Nachfolgende Erkennung der übertragenen HIV-1-RNA durch TLR7 löst die Aktivierung der Myd88 / IRF7 Weges und führt den Typ-I-IFN-Produktion 3 letztendlich. Wichtig ist, dass die zweite Erfassungswegs in pDCs vorhanden, die von TLR9 vermittelt wird, wird durch die Interaktion des viralen Glycoproteins gp120 inhibiert wird, mit dem PDC-spezifische Oberflächenmarker BDCA2 4. <p class="jove_content"&gt; Die TLR7 und TLR9 Erfassungswege von pDC potenziell negativ durch den Eingriff der BST2 (auch Tetherin oder CD317 bezeichnet) mit einer anderen pDC-spezifische Oberfläche inhibitorischen Rezeptor genannt ILT7 5 moduliert werden. BST2 in hohem Ausmaß an der Oberfläche der pDCs und einige Krebszellen exprimiert wird, aber bei relativ niedrigen Konzentrationen in anderen Zelltypen, wie B-Zellen, Makrophagen und T-Zellen. Wichtiger ist, kann BST2 von Typ-I-IFN in einer Reihe von transformierten Zelllinien als auch in primären Zellkulturen von humanen und murinen Ursprungs 6 induziert werden. Abgesehen von ihrer immunregulatorische Funktion, wurde vor kurzem festgestellt BST2 um die Freisetzung von HIV-1 hemmen und anderen umhüllten Viruspartikel durch Vernetzen naszierenden Viruspartikel auf den infizierten Zelloberfläche 7. Im Fall von HIV-1, wurde die viruskodierte akzessorisches Protein U (Vpu) gezeigt, als BST2 Antagonist fungieren. Es wird angenommen, dass Vpu downregulates BST2 von der Zelloberfläche von HIV-1-infizierten Zellen, die Seite der Leineing Aktivität und als Ergebnis verbessert Virusfreisetzung und verbreiten 7, auch wenn dieser Begriff wurde in Frage gestellt 8,9. In Abwesenheit von Vpu, eine große Anzahl von voll ausgebildet und ausgereifte Nachkommen HIV-1-Partikel werden an der Zelloberfläche zurückgehalten wird. Ob diese tethered Partikel könnten wirksame Ziele für Immunsensor stellen nach wie vor eine offene Frage. Außerdem ist unklar, ob Vpu könnte Typ-I-IFN-Produktion von pDCs dysregulate durch Modulation Oberfläche BST2 Ebenen. Frühe Studien zur HIV-1-Erfassung zu beurteilen wurden unter Verwendung von zellfreien HIV-1-Partikeln, die im allgemeinen schlechte Induktoren von Typ-I-IFN 3,10-12 betrachtet werden durchgeführt. Da die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass PBMCs und pDCs HIV-infizierte CD4 + T-Lymphozyten 2,13,14 effizient zu erfassen, beschreiben wir hier eine einfache Methode, um angeborenen Antworten durch pDCs bei Erkennung von HIV-1-infizierten Zellen in vitro ausgelöst messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

HIV-1 angeborenen Erfassungs erfordert direkten Kontakt der infizierten CD4 + T-Zellen mit dendritischen Zellen plasmacytoid (pDC). Um diesen Vorgang zu untersuchen, können die hier beschriebenen Protokolle verwenden Frisch isolierte humane periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) oder plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC), um Infektionen in entweder T-Zelllinie (MT4) oder heterolog primären CD4 + -T-Zellen zu erfassen. Um eine einwandfreie Sensor gewährleisten, ist es wesentlich, dass PBMC werden sofort nach der Blutentnahme und dass eine optimale Prozentsatz von infizierten T-Zellen verwendet werden, isoliert. Weiterhin kann multiparametrischer durchflusszytometrische Färbung verwendet werden, um zu bestätigen, dass PBMC-Proben enthalten, die verschiedenen Zelllinien bei physiologischen Verhältnissen. Eine Reihe von Kontrollen können auch enthalten sein, um die Lebensfähigkeit und Funktionalität pDCs bewerten. Diese umfassen das Vorhandensein spezifischer Oberflächenmarker, die Beurteilung zellulären Reaktionen auf bekannte Agonist des Toll-like Rezeptoren (TLR) Wege und Bestätigen eines fehlenden sponzeitigen Typ-I-Interferon (IFN) Produktion. In diesem System sind frisch isolierte PBMC oder pDCs kokultiviert mit HIV-1 infizierten Zellen in 96-Well-Platten für 18-22 Std. Überstände dieser Co-Kulturen werden dann verwendet, um den Gehalt an bioaktiven Typ-I-IFNs durch die Überwachung der Aktivierung des ISGF3 Wegs in HEK-Blau IFN-α / β-Zellen zu bestimmen. Vor und während der Cokultur Bedingungen können Zielzellen unterzogen werden, um durchflusszytometrische Analyse, um eine Anzahl von Parametern, einschließlich der Anteil der infizierten Zellen, Werte spezifischer Oberflächenmarker, und Differenz Töten von infizierten Zellen zu bestimmen. Obwohl diese Protokolle wurden ursprünglich entwickelt, um Typ-I-IFN-Produktion folgen, könnten sie möglicherweise verwendet, um andere Imuno-modulatorische Moleküle aus pDCs veröffentlicht zu untersuchen und weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen, die HIV-1 angeborenen Erkundung gewinnen werden.

Die in Figur 1 beschriebene Co-Kultursystem ermöglicht eine kontrollierte Studie mit HIV-1 angeborenen Erkundung. Durch die variable Natur der primären Zellen ist es wichtig, dass die normalen Verhältnisse von myeloiden und T-Zellen (CD14 +, und CD3 + jeweils) beobachtet werden, wie in dem in 2A gezeigten Beispiel. Ferner ist nur eine geringe Anzahl von aktivierten T-Zellen (höhere FS und höhere CD3 Ebenen im Vergleich zu nicht-aktivierten T-Zellen) in den frisch isolierten PBMC Kulturen wünschenswert. PBMCs mit abnormalen Verhältnisse zwischen den verschiedenen Zelltypen sind oft nicht in der Lage einen geeigneten Montage angeborene Immunantwort in vitro, wahrscheinlich aufgrund einer bereits aktivierten Phänotyp als Folge einer laufenden Infektion. Am wichtigsten ist, der relative Anteil der pDCs muss, wie in 2B gezeigt, ausgewertet werden. Obwohl dieser Anteil kann 0,2 bis 1,2% variieren kann, ist ein anormaler Sensor Phänotyp auch sowohl mit extre beobachtetmes dieses Bereichs. Anreicherung pDCs Verwendung negativer Selektion ergibt oft 50-95% pDC Reinheit, wie es in den zwei Beispielen von in 2B (92% bzw. 72%) ersichtlich. Ein prototypisches Beispiel für die gesamte Experiment ist in den 3 und 4 gezeigt. In diesem Beispiel wurden MT4-Zellen mit pNL4.3-GFP_ires_Nef WT oder Delta Vpu infiziert zu 30% Befall bei der Co-Kultur (3A) zu erzielen. Wie zuvor beschrieben, werden nur die Infektionen mit wt-Virus zu einer signifikanten Herunterregulierung der Oberflächen BST2 (3B). Aufgrund ihrer Unterschiede in Größe und Granularität kann MT4-Zellen aus PBMCs durch Durchflusszytometrie (4A) leicht unterschieden werden. Nach der Co-Kultivierung Inkubation nur PBMCs in Kontakt mit bekannten TLR7 oder TLR9-Agonisten und PBMCs in Kontakt mit HIV-1 infizierten Zellen freigesetzt werden erhebliche Mengen an Typ-I-IFN (4B). Kein IFN wurden in PBMCs allein erkannt, in PBMCs Co-Cu-ltured mit scheininfizierten MT4-Zellen, oder allein in infizierten MT4-Zellen (4B). In dem hier dargestellten Beispiel wurde angeborenen Erfassen von HIV-1-infizierten MT4-Zellen durch PBMCs insgesamt bedeutend in Gegenwart von Vpu reduziert werden. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Abb. 1: Schematische Darstellung des experimentellen Design SUP: Überstand <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Abbildung 2: Die phänotypische Charakterisierung der frisch isolierten PBMCs und enriched pDCs. (A) Die Normalverteilung von myeloiden Zellen und in PBMC eines gesunden Spenders isoliert beobachteten T-Zellen (Prozentsatz der myeloischen Zellen sollte zwischen 10-20% und T-Zellen 55-65% liegen). PBMCs Probe wurden unter Verwendung von Fluorophor-konjugierten Antikörpern, die Oberfläche CD14 (myeloider Abstammung Marker) und CD3 (T-Zellmarker) erkennen gefärbt. (B) Die phänotypische Charakterisierung von pDCs. Vor der Anreicherung pDCs repräsentieren zwischen 0,2-1,2% der Gesamtzahl der Zellen in den PBMCs (0,99% in dem Beispiel gezeigt). Basierend auf Expression von spezifischen Markern wie BDCA2 und ILT7, an der Zelloberfläche vorhanden sind, können diese Zellen identifiziert werden. Negative Selektion verwendet werden, um die Anzahl der pDCs deutlich bereichern und zu eliminieren potenziell schädlichen Verunreinigungen, wie beispielsweise CD14 + myeloiden Zellen (Anreicherung erreicht 92% und 72% in den zwei Beispielen gezeigt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Abb. 3: Charakterisierung von HIV-1-infizierte Ziel MT4-Zellen (A) Prozentsatz der infizierten Zellen in den Kulturen bei MT4 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT oder dVpu infiziert, wie durch den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen bestimmt. (B) BST2 Zelloberflächenexpression in den infizierten Zellen wurde nach Oberflächenfärbung ausgewertet. Die grauen gefüllt Histogramme stellen mock-infizierten Zellen mit dem Prä-Immun-Kaninchenserum (ungefärbten Kontrolle) angefärbt; die verbleibenden Histogramme repräsentieren Zellen, die mit anti-BST2 polyklonalen Kaninchenserum angefärbt. Histogramme mit durchgezogenen Linien stellen Steuer GFP negativ (neg) Zellen; während Histogramme mit gestrichelten Linien entsprechen den infizierten GFP positive (pos) Zellen. Meine GrippeFluoreszenz-Intensitätswerte (MFI) sind für jede Probe angegeben. Durchflusszytometrie durchgeführt und analysiert, wie in Abbildung 2 beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Abb. 4: Co-Kultur von frisch isolierten PBMCs und infizierten MT4-T-Zellen (A) Vergleich der Durchflusszytometrie allein für MT4-T-Zellen beobachtet FS / SS-Profile, PBMCs allein oder Co-Kulturen von PBMCs und MT4-T-Zellen. Aufgrund von Unterschieden in Größe und Granularität kann MT4 T-Zellen aus PBMCs in Co-Kulturen unter Verwendung von Durchflusszytometrie leicht unterschieden werden. (B) repräsentatives Beispiel für die Menge an Typ-I-IFN nach Stimulation von PBMCs mit TLR-Freigabe7 oder TLR9-Agonisten (vor), oder nach dem Co-Kulturen mit gespielter oder den angegebenen MT4-Zellen mit pNL4.3-GFP_ires_Nef WT oder dVpu infiziert. Rohdaten als OD 650 Werte dargestellt und ihre entsprechenden converseion zu Typ-I-IFN-Konzentration in U / ml ausgedrückt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. at JoVE.com

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Anders als zellfreie HIV-1-Partikeln infiziert sind CD4 + -T-Zellen wirksam durch plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC) abgetastet. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren, bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder isolierten pDCs co-kultiviert, das mit HIV-1 infizierte T-Zellen, um angeborene Erfassung durch pDCs bewerten, wie durch Freisetzung von Typ-I-IFN beurteilt.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K Aufrufe.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  Anders als zellfreie HIV-1-Partikeln infiziert sind CD4 + -T-Zellen wirksam durch plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC) abgetastet. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren, bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder isolierten pDCs co-kultiviert, das mit HIV-1 infizierte T-Zellen, um angeborene Erfassung durch pDCs bewerten, wie durch Freisetzung von Typ-I-IFN beurteilt. 

Serie: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Forschung

Immunologie und Infektion

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC Based Proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1-infizierten Zellen

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...