Der Mikroplatten-Feeder-Assay bietet eine einfache, wirtschaftliche Methode mit hohem Durchsatz zur Messung des Fütterungsverhaltens von Drosophila und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen, ausgefeilteren Methoden. Die Quantifizierung des Verbrauchs durch Messung der Absorption mit einem Plattenleser eliminiert manuelle Messungen und macht die manuelle Dateneingabe überflüssig. Daten sind auch für die programmatische Extraktion und Verarbeitung nutzbar.
Mit diesem Hochdurchsatz-Assay können wir den Verbrauch von wasserlöslichen Nährstoffen, Medikamenten, Pharmazeutika oder Toxinen quantifizieren und das System für Anwendungen bei einer Vielzahl von Insektenarten modifiziert werden. Beginnen Sie, indem Sie die geschmolzene Agarose in einen Reagenztrog gießen und 80 Mikroliter geschmolzene Agarose mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte dosieren. Kühlen Sie die übrig gebliebene Agarose bis zu einer Woche in einem versiegelten Beutel und schmelzen Sie sie für die Herstellung zusätzlicher Teller wieder ein.
Wenn die Barrierestreifen zu locker sind, wickeln Sie sie um den Finger, um ihnen eine Krümmung zu geben, um sie in den Kanälen zu halten. Setzen Sie die Barrierestreifen in die Barrierestreifenkanäle ein, um die Kupplungen vorzubereiten. Befestigen Sie die Kupplung an einer Hungerplatte und stellen Sie sicher, dass Sie die Kupplung nicht verwenden, um die Platte zu manipulieren, da die Kupplung abrutschen kann.
Stellen Sie sicher, dass die abgewinkelte Ecke des Kopplers mit der abgewinkelten Ecke der Mikroplatte übereinstimmt, um die korrekte Ausrichtung beizubehalten. Sortieren Sie unter CO2-Betäubung drei bis fünf Tage alte Fliegen. Laden Sie einzelne Fliegen per Säule in die Hungerplatte.
Schließen Sie jede Spalte, während sie sich füllt, indem Sie ihren Barrierestreifen an die geschlossene Position anpassen. Zeichnen Sie das Probenlayout innerhalb der Mikroplatte sorgfältig auf. Sobald die Hungerplatte gefüllt ist, lassen Sie die Fliegen sich nach dem Entfernen des CO2 spontan erholen und verhungern Sie sie sechs Stunden lang ab ihrer anfänglichen Betäubungszeit.
Bereiten Sie 10 Milliliter flüssige Lebensmittel in einem 15 Milliliter konischen Röhrchen vor, indem Sie 0,4 Gramm Saccharose und 0,1 Gramm Hefeextrakt in 10 Milliliter destilliertem Wasser auflösen. Wirbeln Sie das Rohr vor, bis sich die Feststoffe vollständig auflösen. Fügen Sie 40 Mikroliter Farbstofflösung hinzu und geben Sie das flüssige Lebensmittel in eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einem 0,45-Mikrometer-Filter bestückt ist.
Filtern Sie jeweils etwa 1,5 Milliliter der Lösung in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Spritze mit der Lösung beiseite und filtern Sie die zusätzliche Lösung nach Bedarf während der Zubereitung der Zuführplatte. Bereiten Sie eine Zuführplatte vor, indem Sie den Boden einer 1536-Well-Mikroplatte mit einer Dichtfolie versiegeln.
Verwenden Sie ein Dichtungspaddel, um gründlich an der Folie zu haften. Schneiden Sie dann überschüssigen Film mit einer Rasierklinge vom linken und rechten Rand ab. Dosieren Sie 10 Mikroliter der gefilterten flüssigen Nahrung säulenweise in den oberen linken Brunnen für jeden Cluster von vier Vertiefungen der 1536-Well-Mikroplatte.
Sobald alle Vertiefungen gefüllt sind, tragen Sie eine Siegelfolie auf die Oberseite der Platte auf und befolgen Sie die gleichen Schritte, die zum Versiegeln des Bodens der Mikroplatte verwendet wurden. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Platten. Zentrifugieren Sie die Platten bei 200 mal G für 10 Sekunden, um die Flüssigkeit abzulegen.
Lassen Sie die Platte nicht kühlen, da sich dadurch Kondensation in den Vertiefungen ansammeln und die Absorptionswerte verdecken kann. Perforieren Sie die Vertiefungen auf der Oberseite der Platte mit dem Nadelsondenwerkzeug, das mit einer Nadel mit einem Durchmesser von 0,25 Millimetern ausgestattet ist, und verwenden Sie die gleiche Reihenfolge zum Perforieren, die beim Dosieren der Lösungen verwendet wurde. Wischen Sie die Nadel zwischen den Lösungen ab, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Drehen Sie die Platte um und perforieren Sie die Vertiefungen auf der Unterseite. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 630 Nanometern ohne Deckel ab. Legen Sie einen internen Deckel auf die obere Dichtungsfolie, um sicherzustellen, dass die Kondensationsringe die perforierten Vertiefungen umgeben, und legen Sie dann den externen Deckel auf die Platte.
Legen Sie die Zuführplatte mit der Vorderseite nach oben auf die Kupplung, so dass die Führungen die entsprechenden Löcher der Zuführplatte und der Hungerplatte ausrichten. Stellen Sie sicher, dass die Kupplung und die Platten richtig ausgerichtet sind. Sobald alle Zuführplatten auf die Kupplungen geladen sind, öffnen Sie die Vertiefungen für die Platten, indem Sie die Barrierestreifen an der Kupplung einstellen.
Legen Sie die Kupplungs- und Plattenbaugruppen in den Sekundärbehälter. Legen Sie die untere Hälfte einer Pipettenbox mit eingeweichten Papiertüchern in jeden sekundären Behälter, um Feuchtigkeit zu liefern. Schließen Sie den Deckel des Sekundärbehälters und geben Sie ihn in eine kontrollierte Umgebung.
Lassen Sie die Fliegen 22 Stunden lang verbrauchen. Überprüfen Sie nach den 22 Stunden der Belichtung jede Platte auf tote Fliegen und aktualisieren Sie das Plattenlayout entsprechend. Nachdem alle Platten überprüft wurden, betäuben Sie die Fliegen massenhaft, indem Sie CO2 in den Sekundärbehälter pumpen.
Stellen Sie nach etwa 60 Sekunden sicher, dass alle Fliegen immobilisiert sind. Klopfen Sie die Fliegen vorsichtig in die Hungerplatte und ersetzen Sie die Kunststoffbarrierestreifen. Entfernen Sie die Zuführungsplatten zum Lesen.
Lesen Sie die Absorption der Platte bei 630 Nanometern erneut. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Platten gelesen wurden. Die Verdunstung wurde für jede Bohrung quantifiziert und es wurde festgestellt, dass Korrelationen zwischen den Vertiefungen einzelner Platten bestehen.
Pearson-Korrelationskoeffizienten für Verdunstung versus Zeilen und Verdampfung versus Spalten wurden berechnet, um Trends zwischen Verdunstungs- und Bohrstandorten zu bewerten. Der Verbrauch für drei bis fünf Tage alte Canton-SB-Fliegen wurde quantifiziert, um die Gültigkeit des Protokolls festzustellen. Fliegen hatten die Wahl zwischen einer 4% igen Saccharoselösung mit 1% Hefeextrakt und einer 4% igen Saccharoselösung, ergänzt mit 15% Ethanol und 1% Hefeextrakt.
Sowohl Männchen als auch Weibchen zeigten eine überwältigende Präferenz für die Lösung mit Ethanol und Hefeextrakt. Es ist wichtig, bei der Konstruktion der Feederplatten die Konsistenz zu wahren und sicherzustellen, dass jeder Fliege ein identisches Verzehrszenario in Bezug auf Nahrungsvolumen, Verdunstung und Zugang präsentiert wird. Diese Technik wird es Forschern im Drosophila-Bereich ermöglichen, Hochdurchsatz-Assays für Verbrauchs- und Präferenzverhalten mit höherem Durchsatz und zu niedrigeren Kosten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden durchzuführen.
