Die Autoren danken Arnim Jenett, Aljoscha Nern und anderen Mitgliedern des Rubin-Labors für Beratung und Austausch von unveröffentlichten Reagenzien und Janelia fliegen Licht Projektteam für konfokale Bilder zu erzeugen. Die Autoren danken auch die Mitglieder von Gallien Labor für Kommentare auf das Manuskript.

1. Vorbereitung fliegen für mehrfarbige FlpOut (MCFO) Experimente Hinweis: die MCFO Technik bezieht sich auf eine modifizierte Version der so genannten Flp-vermittelten Stop Kassette Exzision (FlpOut). Transgene MCFO fliegen tragen einen Hitze-Schock-Promotor (Hsp)-Flp Rekombinase und andere Reporter unter UAS zu kontrollieren. Jeder Reporter besteht aus einer gemeinsamen Rückgrat einer Myristoylated (Myr) super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP), in welcher 10 Exemplare eines Epitops Tags (zB., HA, Flagge oder V5) eingelegt. Die daraus resultierende nicht fluoreszierenden Proteine benannt &#34; Spaghettimonster GFPs &#34; (SmGFPs) 14 und detektiert werden mit spezifischen Antikörpern gegen die verschiedenen Epitop Tags.
<ol><li>Fliegt Kreuz mit der MCFO Kassette und die Hsp-Flp (Hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) zu den entsprechenden glialen GAL4 Fahrer Linien (siehe Tabelle der Materialien) .
	<ol><li>Eingerichtet wie der Hsp bereits aktiv bei 25 ° C ist und einige Zellen können Rekombination führt zu einer unspezifischen Kennzeichnung durchlaufen Kreuze bei 18 ° C um Undichtigkeit des Systems zu vermeiden. Warten Sie ca. 20 Tage bei 18 ° C, die F1-Generation zu erhalten. Nach der Hitze Schock (siehe Schritt 2), halten fliegen bei 25 ° C ( Abbildung 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Heat Shock Hinweis: abhängig von der Einstichstelle kann die Effizienz der Hsp-Flp abweichen; daher die optimale Hitze Schock Zeit muss optimiert werden. Für dieses Protokoll ein MCFO fliegen bestand in der Hsp-Flp, auf dem x-Chromosom eingefügt wurde verwendet wurde (siehe Tabelle der Werkstoffe).
<ol><li>Übertragung der Nachkommenschaft des Kreuzes im Schritt 1.1 (F1-Generation fliegt, 3-4 Tage alt) in neue Ampullen mit Nahrung und Wärme schockieren sie bei 37 ° C in einem Wasserbad. 
	Hinweis: Junge fliegen (1-2 Tage alt) sind sehr empfindlich gegenüber Hitzeschock. Warten Sie 1 oder 2 Tage vor der Durchführung der Hitzeschock um die Sterblichkeit infolge der Behandlung zu verringern. Verwenden einige der F1-Generation fliegt als ein Steuerelement ohne Hitzeschock.</li>
	<li>Während der Hitzeschock fliegen in normalen Fläschchen mit Lebensmitteln aufrechtzuerhalten, um die Rate der Stress-induzierte Sterblichkeit zu verringern. Weibchen und Männchen in separaten Fläschchen setzen.</li>
	<li>Achten Sie darauf, das gesamte Fläschchen in das Wasser zu einer homogenen Hitzeschock gewährleisten eintauchen. Verwenden Sie einen 5-8 min Schock als ein geeigneter Ausgangspunkt für spärlich Kennzeichnung von Glia-Zellen mit vielen GAL4 Fahrer Linien; die Schock-Dauer muss für jeden Fahrer und Experiment (kürzere oder längere Hitze Schock mal möglicherweise erforderlich) optimiert werden.</li>
	<li>Nach der Hitzeschock lag die Flaschen horizontal auf der Bank für ein paar Minuten damit die fliegen von der Hitzeschock erholen können. 
	Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Fläschchen ändern.</li>
	<li>Pflegen die fliegen bei 25 ° C und sezieren (siehe Schritt 3 und 4) sie mindestens 2 Tage nach dem Hitzeschock für optimale Reporter Ausdruck.</li>
</ol> 3. Dissektion Vorbereitung und Lösungen <ol><li>Tag der Dissektion, bereiten frische Fixativ Lösung in 200 µL PCR Schläuche durch das Mischen von 180 µL S2 Zellkulturmedium mit 20 µL 20 % Paraformaldehyd (PFA), eine 2 % PFA-Lösung zu erhalten. Wartung der Fixativ Lösung auf dem Eis vor und während der Dissektion. 
	Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden. 
	Hinweis: 160 µL S2 Zellkulturmedium mit 40 µL 20 % Paraformaldehyd (PFA) in einem 200 µL PCR-Röhrchen, bereiten Sie eine 4 % PFA Lösung anstelle einer 2 % igen Lösung mischen.</li>
	<li>Verwenden eine PCR-Röhrchen pro Genotyp mit maximal 8-10 Köpfe pro Röhre für optimale Färbung Ergebnisse.</li>
	<li>Bereiten die Erwachsene Gehirn Waschlösung: 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,5 % Triton x-100 in PBS. 
	Hinweis: Je nach der Färbung, einer Lösung mit 1 % sein Triton x-100 erforderlich. Eine höhere Konzentration von Triton x-100 erhöht die Penetration des Antikörpers ins Gewebe und es ist notwendig, Fleck-Regionen, die tief in das Gewebe (z. B. synaptischen Regionen im erwachsenen Gehirn Drosophila) liegen.</li>
	<li>Bereiten Sie die blockierende Lösung: 3 % normalem Ziegenserum, 3 % normale Esel Serum und 0,5 % Triton x-100 in PBS.</li>
	<li>Erwachsene Gehirn waschen und die blockierende Lösung ein paar Wochen bei 4 ° C gelagert werden.</li>
	<li>Tiefe Depression Brunnen Glasplatte auf Eis gelegt und füllen jeweils auch mit den folgenden Lösungen: mit 70 % Ethanol, mit PBS und mit S2 Zellkulturmedium.</li>
</ol> 4. Erwachsenen Gehirn Dissektion <ol><li>3 cm Teller auf der Bühne eines Stereomikroskops sezieren zu positionieren und füllen Sie ihn mit kaltem S2 Zellkulturmedium. Führen Sie alle Sektionen in diesem Medium um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Verfahrens der Dissektion gesund bleibt. 
	Hinweis: Verwenden Sie einen sezierenden Teller, gesäumt von mehreren Millimetern von schwarzem Silikon sorgt für einen guten Hintergrundkontrast (in den Bildern) und bewahren die Zange während der Dissektion.</li>
	<li>Betäuben die fliegen von der gewünschten Genotyp mit CO 2.</li>
	<li>Mit der Pinzette, greifen die Fly-by-Flügel und waschen Sie ihn in kaltem 70 % igem Ethanol für 30 s, dann mit kaltem PBS für zusätzliche 30 s.</li>
	<li>Übertragen die Fliege in die Tiefe Depression gut, die gefüllt ist mit S2 Zellkulturmedium.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang für alle fliegen des gleichen Genotyps und pflegen sie in kalten S2 Zellkulturmedium bis Dissektion, die das Gewebe erhalten. 
	Hinweis: Zu betäuben, nur die Anzahl der fliegen, die in einem Zeitraum von ca. 30 min. langen Inkubationszeiten in S2 Zellkulturmedium seziert werden kann das Gewebe schädigen kann.</li>
	<li>Im laufenden Betrieb mit Zange greifen und unter einem Stereomikroskop tauchen die Fliege in S2 Zellkulturmedium.</li>
	<li>Trennen den Kopf vom Rest des Körpers. Verwerfen Sie den Körper und halten Sie den Kopf in S2 Zellkulturmedium getaucht. Es ist äußerst wichtig, den Kopf mit der Pinzette für die gesamte Dauer der Dissektion zu halten. Wenn der Kopf beginnt zu schweben, es wird schwierig sein, es abzurufen, ohne das Gewebe zu schädigen.</li>
	<li>Beginnen die Zerlegung durch Herausziehen eines Auges, während Sie den Kopf mit mindestens eine Zange zu allen Zeiten halten. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Zange direkt unterhalb der Netzhaut zu vermeiden das Gewebe unterhalb schadet. Ziehen Sie das andere Auge und beginnen, entfernen der Nagelhaut, bis das Gehirn erscheint.</li>
	<li>Entfernen Sie alle trachealen Gewebe und Nagelhaut um das Gehirn herum, bis das Gewebe sauber erscheint. Achten Sie darauf, alle trachealen Gewebe um das Gehirn für optimale Färbung Ergebnisse zu entfernen; die Gewebe sind jetzt bereit, fixiert und gefärbt werden.</li>
	<li>Pflegen die seziert Köpfe in kalten S2 Zelle Kulturmedium vor der Übertragung in die PFA-Lösung um die Fixierung Schritt Zeit.</li>
</ol> 5. Erwachsenen Gehirn Färbung < Ol> <li>Übertragen die isolierte Gehirn mit einer P10-Pipette in die PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT). Um Gewebeschäden zu vermeiden, verwenden Sie niemals Pinzetten für die Übertragung von den Gehirnen nach der Präparation. Führen Sie alle Schritte in 200 µL PCR Röhren auf ein Nutator.</li>
	<li>Für alle Schritte, bevor verwerfen die alte Lösung mit einer Pipette P200 lassen Sie die Köpfe auf den Boden des Röhrchens zu Regeln. Versuchen Sie, den Überstand zu entfernen, ohne das Gewebe absaugen. Das Gewebe vor Lichteinwirkung schützen.</li>
	<li>Fixieren die Köpfe in 200 µL 2 % PFA in S2 Zellkulturmedium für 1 h oder 4 % PFA für 30 Minuten. Halten die Fixierung Mal identisch zwischen Proben um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.</li>
	<li>Nach 3 (oder mehr) von jeweils 15 Minuten in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung, wäscht blockieren die Gewebe mit 200 µL Lösung für 30 Minuten zu blockieren. Längere Inkubationszeiten bei der Blockierung Lösung sind möglich.</li>
	<li>Inkubieren die Gehirn über Nacht bei 4 ° C mit verdünnt im erwachsenen Gehirn Waschlösung in einem Gesamtvolumen von 200 µL Primärantikörper. 
	Hinweis: Die Inkubationszeiten variieren je nach Art der Antikörper verwendet. Längere Inkubationen können erforderlich sein.
	<ol><li>Für die Bezeichnung der drei MCFO Marker, brüten die Gehirne mit anti-HA (1: 500), Anti-FLAG (DYKDDDDK Epitop) (1: 100), und Anti-V5 Primärantikörper.</li>
		<li>Primäre direkt konjugierten Antikörpern könnte statt der normalen primären + sekundäre Kombination verwendet werden (zB., Anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). In diesem Fall behandeln die direkt konjugierten Antikörper als Sekundärantikörper. 
		Hinweis: Für jeden Genotyp halten Sie einige Gehirne als Steuerelemente, die Spezifität der Färbung zu überprüfen. Die Primärantikörper Inkubation zu überspringen und direkt zum nächsten Schritt gehen.</li>
	</ol></li> <li>Waschen Gewebe 3 Mal für 1 h in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung (Schritt 3.3) und inkubieren sie mit Fluorophor-Konjugate/primär direkt konjugierten Sekundärantikörper verdünnt im erwachsenen Gehirn Waschlösung über Nacht bei 4 ° C oder 4 h bei RT, in einem Gesamtvolumen von 200 µL Hinweis: Beispiele für entsprechende Antikörper: AlexaFluor 488 (1: 250), Anti-V5:DyLight 549 (1: 200) und DyLight 647 (1: 100)-konjugierten Antikörpern.</li>
	<li>Waschen die Köpfe 3 Mal für 1 h in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung, gefolgt von einer endgültigen waschen in 200 µL PBS über Nacht bei 4 ° C oder 1-2 h bei RT; die letzten Waschschritt mit PBS-Puffer entfernt alle Spuren von Triton x-100 und ist notwendig für optimale Färbung Ergebnisse. Montieren Sie die Köpfe in Eindeckmittel mit einem Anti-Fade-Agenten auf Glasdeckgläser.</li>
</ol> 6. Für die Bildgebung des Gehirns Montage <ol><li>Trim eine Bildgebung Abstandhalter auf die entsprechende Größe mit einer Schere. Für hochauflösende Mikroskopie, sandwich-Probe und Bildgebung Abstandhalter zwischen zwei Glasdeckgläser. 
	Hinweis: Imaging Distanzscheiben sind dünne (0,12 mm dick) selbstklebende Abstandshalter, die Schale und halten Sie sich an Deckgläsern oder Mikroskop Objektträger, ermöglicht die Montage von Proben ohne Komprimierung.</li>
	<li>Mit Zange, entfernen Sie die selbstklebende Folie von einer Oberfläche und Spacer, klebende Seite nach unten, auf der Oberfläche von einem Glas Deckgläschen (22 x 60 mm). Ein neues Glas Deckglas 10 µL Eindeckmedium zuweisen.</li>
	<li>Mit ein P10 Pipette, übertragen die Gehirne aus 200 µL Tube, Deckglas, neben den Tropfen Eindeckmittel. Zusammen mit den Geweben, einige PBS zu übertragen, um die Köpfe in Lösung halten.</li>
	<li>Mit ein P10 Pipette, bewegen die Gehirne von PBS bis zum Tropfen Eindeckmittel versuchen, die Menge der PBS zu begrenzen. Übertragen Sie die Exemplare in Eindeckmittel auf das Deckglas mit bildgebenden Abstandhalter. Genügend Montage Medien nutzen, um die Probe zu decken.</li>
	<li>Die selbstklebende Folie von der Oberseite der Abstandhalter entfernen und hinzufügen ein Glas Deckglas auf die Proben. Wenden Sie mit einer Pinzette einen sanften Druck über die Klebefläche zu versiegeln. Bild der montierten Gewebe sofort oder lagern Sie die Folien bei-20 ° C für eine spätere Analyse.</li>
</ol> 7. Bild Erwerb <ol><li>Acquire Stapel konfokale Fluoreszenz-Bilder mit einem confocal Mikroskop mit einem 40 X (NA = 1.2, Eintauchen in Wasser) Ziel oder 63 X (NA = 1.4, Ölimmersion) Ziel (Pixelgrößen = 1.024 x 1.024 in der Xy-Ebene; Abstand zwischen zwei konfokalen Abschnitte = 0,5 µm). Stellen Sie Detektor Gain und Offset in jedem Kanal in einer Weise, dass keine gesättigten Pixel und Null Pixelwerte in den Bildern vorhanden sind; Dies vermeidet Informationsverluste und sorgt für den vollen Dynamikumfang des Detektors. 
	Hinweis: Da 3D-Bildgebung zeitaufwändig ist, können durch das Scannen mehrerer Proben parallel an verschiedenen Orten die Messungen automatisiert werden. Verwenden Sie zur Vermeidung von Verdampfung mit dem Ziel, Wasser eintauchen Spezialöl eintauchen Medium mit Brechungsindex n = 1,33.</li>
	<li>Verarbeiten die konfokale Stacks für maximale Dichte Projektionen, Änderungen im Kanal Farbton und Anpassung von Helligkeit und Kontrast mit jedem standard-Image-Analyse-Software (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren keine konkurrierende oder widersprüchliche Interessen.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode, um die Morphologie der verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes von Interesse in hoher Auflösung zu studieren. Mit der MCFO Technik mehrere Reporter mit verschiedenen Epitop-Tags in Kombination multicolor stochastische Kennzeichnung (Abbildung 2) dienen. Ähnlich wie bei anderen Methoden wie Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO erhö...

Glia, der nicht-neuronale Zellpopulation des Nervensystems (NS), waren lange geglaubt, um einen statischen Rahmen für Neuronen und wurden daher nicht im Detail untersucht. Jedoch beim Menschen, Glia bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in der NS (~ 90 %) und fallen in verschiedene Kategorien, darunter Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und Schwann-Zellen. In DrosophilaGlia sind etwa 10 % der Zellen in der NS. Faszinierenderweise sind ihren Morphologien und Funktionen bemerkenswert ähnlich denen in Wirbeltieren1,2. Ihre Morphologien gehören Blut - Hirn-Schranke (BBB) Epithelien, Ensheathing und Astrozyten-wie Zellen bilden.
Die Drosophila Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus folgenden Grundstrukturen: Cortex-Regionen, die enthalten die neuronalen Zellkörpern; Neuropils, die synaptische Verbindungen zu beherbergen; kleine und große Axon Traktate, die die verschiedenen Neuropiles zu verbinden; periphere Nerven, die Sinnesorgane und Muskeln mit CNS (Abbildung 1) zu verbinden. Glia sind assoziiert mit diesen anatomischen Strukturen gefunden: Cortex Glia (CG) in den kortikalen Regionen, Astrozyten-ähnliche Glia (ALG) und Ensheathing Glia (EG) in den Neuropile Regionen, Ensheathing Glia sind auch zentrale Axon Traktate und peripheren zugeordnet Nerven (EGN), und schließlich zwei folienartigen Glia, perineurial Glia (PG) und subperineurial (SPG), die zusammen bilden eine zusammenhängenden Schicht, die die gesamte NS (Abbildung 2) abdeckt.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der NS; Sie überwachen neuronale Zelle Zahlen durch Reaktion auf systemisch zirkulierende Insulin-Like-Peptide, Neuronen, wie z. B. die Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle, trophische unterstützen und beseitigen sterbende Neuronen durch Phagozytose3,4 , 5 , 6. in die Reife NS Glia pflegen die BBB Neurotransmitter nehmen Ionischen Homöostase aufrechtzuerhalten, und fungieren als wichtigeren Immunzellen in der NS, da Makrophagen nicht die BBB verletzen und synaptische Aktivität sowie das Verhalten der Tiere6 moduliert , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Ob der glialen Subtypen spezialisierte Funktionen ausführen, bleibt eine wichtige offene Frage. Jedoch wurde eine systematische genomweite Analyse der Glia, vor allem bei den Erwachsenen, durch einen Mangel an geeigneten genetischen Tools für ihre Handhabung behindert. Hier ist eine Methode, die ermöglicht die effiziente und einfache Charakterisierung der Zellformen zu komplexen Zellezelle Interaktionen zu untersuchen präsentiert. Diese Technik wurde zur Charakterisierung der Morphologie der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila angewandt, aber abhängig von den jeweiligen GAL4-Treiber verwendet, es kann angepasst werden, um Neuronen12,13 studieren , jede Art von Vermischung Zellen und im Prinzip jedes Gewebe in alle Entwicklungsstadien.

<table><tbody><tr><td>Water bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>Glass dissection dish</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Glass dissection plates</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>home made with charcoal</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 cell culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HA-tag</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>Primary antibody, dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Primary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Secondary antibody, dilution 1:250</td></tr><tr><td>anti-rat DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Secondary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Contact company for ordering</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software for automated scanning</td></tr></tbody></table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und komplexen anatomischen Verhältnisse. Wie interagieren die Zellen mit ihren Nachbarn? Unterscheiden sich die Wechselwirkungen zwischen Zelltypen oder sogar innerhalb eines bestimmten Typs? Welche Arten von räumlichen Regeln folgen sie? Die Antworten auf solche grundlegenden Fragen in Vivo haben bisher durch einen Mangel an Tools für hochauflösende Einzelzelle Kennzeichnung behindert worden. Hier steht ein detailliertes Protokoll auf einzelne Zellen mit einer mehrfarbigen FlpOut (MCFO) Technik zur Verfügung. Diese Methode beruht auf drei unterschiedlich tagged Reporter (HA, Flagge und V5) unter FH-Kontrolle, die durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) still gehalten werden. Ein Hitze-Schock-Puls induziert die Expression von einer Hitze Schock-induzierte Flp Rekombinase, die nach dem Zufallsprinzip die FRT-Stop-FRT-Kassetten in einzelnen Zellen entfernt: Ausdruck tritt nur in Zellen, die auch einen GAL4-Fahrer zum Ausdruck bringen. Dies führt zu einer Reihe von unterschiedlich gefärbten Zellen von einem bestimmten Zelltyp, der die Visualisierung der einzelnen Zelle Morphologien in hoher Auflösung ermöglicht. Als Beispiel kann die MCFO Technik mit spezifischen Glia GAL4-Treibern, die Morphologien der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila zu visualisieren kombiniert werden.

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mithilfe der MCFO-Technik im erwachsenen Gehirn Drosophila abgerufen werden können. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der Methode. Drei unterschiedlich Membran-Tags Reporter (Myr-SmGFP-HA, Myr-SmGFP-FLAG und Myr-SmGFP-V5) unter Kontrolle der FH sind durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) geschwiegen. Ein Hitze-Sch...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und eine Vielzahl von Interaktionen mit ihren Nachbarn zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt, die Morphologie der Einzelzellen zu offenbaren und Zell-Zell-Interaktion mithilfe der etablierten Gal4/UAS-Expressionssystem zu untersuchen.

Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

8.1K Aufrufe.  Ludwig-Maximilians-University Munich. Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und eine Vielzahl von Interaktionen mit ihren Nachbarn zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt, die Morphologie der Einzelzellen zu offenbaren und Zell-Zell-Interaktion mithilfe der etablierten Gal4/UAS-Expressionssystem zu untersuchen.

Serie: Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Entwicklungsbiologie

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biologie

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...