Анализ микропластинчатой подачи обеспечивает простой, высокопроизводительный, экономичный метод измерения пищевого поведения дрозофилы и предлагает множество преимуществ по сравнению с другими, более сложными методами. Количественная оценка расхода путем измерения поглощения с помощью пластинчатого считывателя исключает ручные измерения и исключает ручной ввод данных. Данные также поддаются программному извлечению и обработке.
С помощью этого высокопроизводительного анализа мы можем количественно оценить потребление водорастворимых питательных веществ, лекарств, фармацевтических препаратов или токсинов, и система может быть модифицирована для применения к различным видам насекомых. Начните с разлива расплавленной агарозы в реагентную желоб и дозируйте 80 микролитров расплавленной агарозы в каждую лунку 96-лунки микропластины с помощью многоканальной пипетки. Охладить оставшуюся агарозу до недели в герметичном пакете и переплавлить ее для изготовления дополнительных пластин.
Если барьерные полосы слишком свободны, обвяжите их вокруг пальца, чтобы придать им кривизну, чтобы удерживать их в каналах. Вставьте барьерные полосы в каналы барьерной полосы для подготовки муфт. Прикрепите муфту к голодной пластине, следя за тем, чтобы не использовать муфту для манипулирования пластиной, так как муфта может соскользнуть.
Убедитесь, что угловой угол соединительного муфты соответствует угловым углам микропластины, чтобы сохранить правильную ориентацию. Под анестезией CO2 сортируйте трех-пятидневных мух. Загружайте отдельных мух колонной в пластину голодания.
Закройте каждый столбец по мере его заполнения, отрегулировав его барьерную полосу в закрытое положение. Тщательно запишите макет образца внутри микропластины. Как только пластина голодания будет заполнена, позвольте мухам спонтанно восстановиться после удаления CO2 и голодайте их в течение шести часов, начиная с их первоначального времени обезболивания.
Приготовьте 10 миллилитров жидкой пищи в конической пробирке объемом 15 миллилитров, растворив 0,4 грамма сахарозы и 0,1 грамма дрожжевого экстракта в 10 миллилитрах дистиллированной воды. Вихряйте трубку до тех пор, пока твердые вещества полностью не растворятся. Добавьте 40 микролитров раствора красителя и переложите жидкую пищу в шприц на 10 миллилитров с фильтром 0,45 микрометра.
Фильтруйте приблизительно 1,5 миллилитра раствора за один раз в 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Отложите шприц, содержащий раствор, в сторону и отфильтруйте дополнительный раствор по мере необходимости во время приготовления питательной пластины. Подготовьте питательную пластину, запечатав дно микропластины из 1536 скважин уплотнительной пленкой.
Используйте уплотнительное весло, чтобы тщательно прилипать к пленке. Затем обрежьте лишнюю пленку с левого и правого краев лезвием бритвы. Распределить 10 микролитров отфильтроированной жидкой пищи в верхнем левом колодце для каждого кластера из четырех скважин микропластины из 1536 скважин.
После того, как все колодцы заполнены, нанесите уплотнителюющую пленку на верхнюю часть пластины, следуя тем же шагам, которые используются для герметизации нижней части микропластины. Повторите для нужного количества пластин. Центрифугировать пластины в 200 раз G в течение 10 секунд, чтобы оседать жидкость.
Не позволяйте пластине охлаждаться, так как это может привести к накоплению конденсата в скважинах, заслоняя показания поглощения. Перфорировать колодцы на верхней поверхности пластины игольчатым зондовым инструментом, оснащенным иглой диаметром 0,25 миллиметра, используя тот же порядок перфорации, который использовался при дозировании растворов. Протрите иглу между растворами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
Переверните плиту и перфорируют колодцы на дне. Считывание поглощения пластины на 630 нанометров без крышки. Поместите внутреннюю крышку на верхнюю уплотнителевую пленку, чтобы убедиться, что конденсационные кольца окружают перфорированные колодцы, затем поместите внешнюю крышку на пластину.
Поместите питательную пластину лицевой стороной вверх на муфту таким образом, чтобы направляющие выровняли соответствующие отверстия пластины питателя и пластины голодания. Убедитесь, что соединитель и пластины правильно ориентированы. После того, как все фидерные пластины загружены на муфты, откройте колодцы для плит, отрегулировав барьерные полосы на соединителях.
Поместите соединитель и пластинчатые узлы во вторичный контейнер. Поместите нижнюю половину коробки для пипетки, содержащую размоченные бумажные полотенца, в каждый дополнительный контейнер, чтобы обеспечить влажность. Закройте крышку вторичного контейнера и перенесите его в контролируемую среду.
Дайте мухам потреблять в течение 22 часов. После 22 часов воздействия проверьте каждую пластину на наличие мертвых мух и обновите макет пластины соответствующим образом. После того, как все пластины проверены, обезболивайте мух в массовом порядке, закачивая CO2 внутрь вторичного контейнера.
Примерно через 60 секунд убедитесь, что все мухи обездвижены. Осторожно постучите мухами в пластину голодания и замените пластиковые барьерные полосы. Снимите фидерные пластины для считывания.
Перечитайте поглощение пластины на 630 нанометров. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будут прочитаны все пластины. Испарение было количественно оценено для каждой скважины и было обнаружено, что определяет, существуют ли какие-либо корреляции между скважинами отдельных плит.
Коэффициенты корреляции Пирсона для испарения по отношению к рядам и испарения по отношению к столбцам были рассчитаны для оценки тенденций между испарением и расположением скважины. Потребление трех-пятидневных мух Canton-SB было количественно определено, чтобы установить действительность протокола. Мухам был предоставлен выбор между 4% раствором сахарозы с 1% дрожжевым экстрактом и 4% раствором сахарозы, дополненным 15% этанолом и 1% дрожжевым экстрактом.
Как мужчины, так и женщины показали подавляющее предпочтение раствору с этанолом и дрожжевым экстрактом. Важно поддерживать последовательность при строительстве фидерных пластин, гарантируя, что каждая муха представлена с идентичным сценарием потребления в отношении объема пищи, испарения и доступа. Этот метод позволит исследователям в области дрозофилы выполнять высокопроизводительный анализ потребления и предпочтительного поведения с более высокой пропускной способностью и с более низкой стоимостью по сравнению с традиционными методами.
