マイクロプレートフィーダーアッセイは、ショウジョウバエの摂食行動を測定するためのシンプルで高スループットで経済的な方法を提供し、他のより精巧な方法よりも複数の利点を提供します。プレートリーダーで吸光度を測定することで消費を定量化することで、手動測定を排除し、手動でのデータ入力を排除します。データは、プログラムによる抽出や処理にも適しています。
この高スループットアッセイにより、水溶性栄養素、医薬品、医薬品、毒素の消費量を定量化することができ、様々な昆虫種への適用のためにシステムを変更することができます。溶融アガロースを試薬トラフに注ぎ、マルチチャネルピペットを使用して96ウェルマイクロプレートの各ウェルに80マイクロリットルの溶融アガロースを分配します。残ったアガロースを密閉した袋に入れ、再溶融して追加のプレートを作ります。
バリアストリップが緩み過ぎる場合は、指の周りにそれらを巻き付けて、チャネルでそれらを保持するために曲率を与えます。バリアストリップをバリアストリップチャンネルに挿入して、カプラーを準備します。カプラーを飢えプレートに貼り付け、カプラーが滑り落ちる可能性があるため、カプラーを使用してプレートを操作しないようにします。
カプラーの角度のあるコーナーが、正しい方向を維持するために、マイクロプレートの角度付きコーナーと一致していることを確認します。CO2麻酔の下で、3〜5日齢のハエを選別します。個々のハエを柱で飢餓プレートにロードします。
各列を閉じ、そのバリア ストリップを閉じた位置に調整して、塗りつぶしに合わせて閉じます。マイクロプレート内のサンプルレイアウトを注意深く記録します。飢餓プレートが満杯になったら、ハエがCO2を取り除いた後に自発的に回復し、最初の麻酔時間から6時間飢えさせます。
10ミリリットルの蒸留水に0.4グラムのスクロースと0.1グラムの酵母エキスを溶解して、15ミリリットルの円錐管に10ミリリットルの液体食品を調製します。固体が完全に溶解するまでチューブをボルテックスします。40マイクロリットルの染料ストック液を加え、液体食品を0.45マイクロメートルフィルターでチップした10ミリリットルのシリンジに移します。
1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに一度に約1.5ミリリットルの溶液をフィルターします。溶液を含むシリンジを脇に置き、フィーダープレートの調製中に必要に応じて追加の溶液をフィルター処理します。1536ウェルマイクロプレートの底部をシールフィルムで密封してフィーダープレートを準備します。
シールパドルを使用してフィルムに完全に付着します。次に、カミソリの刃で、左右の端から余分なフィルムをトリミングします。1536ウェルマイクロプレートの4つのウェルの各クラスターについて、濾過された液体食品の10マイクロリットルを左上ウェルに縦方向に分配します。
すべてのウェルが充填されたら、マイクロプレートの底部を密封するために使用されるのと同じ手順に従って、プレートの上部にシールフィルムを塗布します。希望するプレート数に対して繰り返します。プレートを200倍Gで10秒間遠心分離し、液体を沈着させます。
これは、吸収度の測定値を隠し、凝縮を引き起こす可能性があるため、プレートを冷やすようにしないでください。直径0.25ミリメートルの針を装備した針プローブツールでプレートの上面のウェルを穿孔し、溶液を分配する際に使用したのと同じ順序で穿孔します。クロスコンタミネーションを防ぐために、溶液間の針を拭き取ります。
プレートをめくり、底の井戸を穿穿けます。蓋なしで630ナノメートルでプレートの吸光度を読み取ります。上部のシールフィルムに内部蓋を置き、凝縮リングが穿光井戸を囲むよう、外蓋をプレートに置きます。
ガイドがフィーダープレートと飢餓プレートの適切な穴を揃えるよう、ボンプラーの上にフィーダープレートを上に置きます。カプラーとプレートの向きが正しいことを確認します。すべてのフィーダープレートがカプラーにロードされたら、カプラーのバリアストリップを調整してプレートの井戸を開きます。
カプラーとプレートアセンブリを 2 次コンテナに配置します。浸したペーパータオルを入れたピペットボックスの下半分を各二次容器に入れて湿度を提供します。二次コンテナの蓋を閉じ、制御された環境に移します。
ハエが22時間消費することを許可します。22時間の露出後、各プレートに死んだハエがないか確認し、それに応じてプレートのレイアウトを更新します。すべてのプレートをチェックした後、二次容器の中にCO2をポンピングすることによって、ハエを一斉に麻酔します。
約60秒後、すべてのハエが固定されていることを確認してください。ハエを飢餓プレートにそっとタップし、プラスチックバリアストリップを交換します。読み取り用のフィーダープレートを取り外します。
プレートの吸光度を630ナノメートルで再読み込みします。すべてのプレートが読み取られるまで、このプロセスを繰り返します。蒸発は、すべてのウェルについて定量化され、個々のプレートのウェル間に相関関係が存在するかどうかを判断することが判明した。
蒸発と行と蒸発対カラムのピアソン相関係数を計算し、蒸発と井戸の位置の間の傾向を評価した。3〜5日齢のカントン-SBハエの消費は、プロトコルの有効性を確立するために定量化されました。ハエは、1%酵母抽出物を含む4%スクロース溶液と、15%エタノールと1%酵母抽出物を添加した4%スクロース溶液の間で選択を与えられた。
男性と女性の両方がエタノールと酵母エキスで溶液の圧倒的な好みを示しました。フィーダープレートを構築する際には一貫性を保ち、各フライに食品の量、蒸発、アクセスに関して同一の消費シナリオが提示されるようにすることが不可欠です。この技術により、ショウジョウバエ分野の研究者は、従来の方法と比較して、より高いスループットと低コストで消費と好み行動に対してハイスループットアッセイを実行することができます。
